微量双链 DNA 定量试剂盒实验步骤:
1、实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)。
2、取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀。
3、65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次。
4、加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)。
5、取上清,等体积的:(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)。
6、加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)。
7、10,000rpm,4℃离心20min。
8、弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀。
9、酚::(25:24:1)抽提两次,:(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)。
10、加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上。
11、12,000rpm,4℃离心20 min。
12、弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥。
13、加200ul的DEPC处理水溶解。
14、用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量。
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)