实验流程：
从细胞材料中提取 RNA→RNA 加入到含有逆转录酶、引物、dNTPs 的反应体系中→退火，引物与 RNA 链配对→延伸，逆转录酶合成互补 cDNA 链变性→常规 PCR 反应流程（变性、退火、延伸，如此多次循环）。
RT-PCR“两步法"与“一步法"：
RT-PCR 的实验操作分为“一步法"与“两步法"两种。一步法 RT-PCR 能克隆微量 mRNA 而不需构建 cDNA 文库（即 cDNA 合成与 PCR 反应在同一 Buffer 及酶中进行，一步法完成），省略了 cDNA 与 PCR 之间的过程。两步法 RT-PCR 首先用反转录酶合成 cDNA，然后以 cDNA 为模板进行 PCR，即 RNA 反转录与 PCR 扩增分两步进行。一步法 RT-PCR 与两步法相比快速、简便、减少了污染机会、减少了 RNA 二级结构、减少了 PCR 反应的错配率。RT-PCR 两步法的优势在于存在中间产物 cDNA，便于保存；且第2步 PCR 只取逆转录反应产物的 1/10 进行反应，有利于 PCR 条件的调整，实验重现性强；两步法可以在第2步 PCR 反应体系中加入特异性引物，其灵敏度比一步法高；两步法的实验预算要低于一步法。但是由于两步法包括第1链 cDNA 合成和随后的 PCR 反应，容易产生污染问题。
实验操作注意事项：
1、RNA 提取一定要迅速，样本要新鲜，组织尽量在液氮中研磨；
2、 RNA 提取完马上进行逆转录不要拖延，新提的 RNA 很容易降解；
3、逆转录反应过程，需建立无 RNAase 环境，以避免模板 RNA 降解；
注：
RNase 是 RNA 水解酶的统称，包含 RNase A，RNase H 等，RNase A 可以水解单双链 RNA，RNase H 主要水解 RNA 与 DNA 杂交双链中的 RNA。