操作流程:
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
产品特点：
1、公司产品仅用于科研不需要单独纯化线粒体，柱式法纯化，操作简单快捷。
2、得到的mtDNA可以直接用于PCR和酶切。
3、每107个动物细胞一般能得到100ng左右的mtDNA，每克组织一般能得到3～5μg mtDNA。
注意：本产品只适合于动物材料，不适合于植物材料，因为植物线粒体DNA一般都十分巨大,非常难提。
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产品名称
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巨大芽孢杆菌染料法qPCR试剂盒
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规格
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50次
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货号
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FS-01P98941
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产品组成:
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成分
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规格
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溶液A
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13ml
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溶液B
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13ml
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溶液C
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18ml
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离心吸附柱
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50套
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通用洗柱液
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50ml
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DNA洗脱液
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10ml
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说明书
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1份
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使用方法:
一:培养细胞预处理
1. 用自备的0.25%胰酶消化液处理约107个培养细胞,离心收集后弃上清。
2. 用PBS或TBS等缓冲液洗涤细胞两次,离心得到的细胞沉淀直接用于mtDNA提取。
二:组织细胞预处理
3. 用剪刀将1g新鲜的动物组织剪碎(芝麻大小*),转移到1.5mL塑料离心管中,用于mtDNA提取。注意:*不要使用冻存的动物组织,因为冻凝过程中形成的冰晶会将线粒体刺破,使其DNA释放出来被胞浆中的DNA酶降解,影响回收率。
三:血液预处理
4. 将3-5mL抗凝外周血静置30分钟或低速离心5分钟,取白细胞层。
5. 用自备PBS洗涤白细胞两次,得到的白细胞沉淀用于mtDNA提取。
柱式动物线粒体DNA提取试剂盒(PCR级)四:mtDNA提取
5.在细胞沉淀或剪碎的组织中加入250μL冰浴的溶液A,充分吹打分散。如果是剪碎的组织,不要等成块的组织溶解即可继续下步操作。
6. 加入250μL常温的溶液B(如果溶液B有沉淀,用前须37℃加热溶解后冷却到室温方可使用),温和反复颠倒混匀10次。千万不要剧烈振荡。
7. 冰上放置6-8分钟。注意不要超过8分钟。
8. 加入350μL冰浴的溶液C,温和混匀4-6次,可见白色沉淀物产生,然后放冰上放置20-25分钟。
9.室温12000~15000g离心10分钟,小心将上清液转移到离心吸附柱中。由于此时的溶液比重较大,有时候出现沉淀漂浮是正常现象,取上清时避开漂浮的沉淀即可。
10. 静置5分钟以让DNA与离心吸附柱充分结合,此步十分重要。
11.室温12000~15000g离心1分钟,弃收集管中的废液。
12. 加入500μL的通用洗柱液,室温12000~15000g离心1分钟,弃收集管中废液。
注意:通用洗柱液中含乙醇,用后需要将盖拧紧存放,否则乙醇会挥发。
13. 重复上步1次。
14.室温12000~15000g离心1分钟,甩干残留液体。此步不能省略,否则残留乙醇会影响DNA的后续使用(如DNA上样时不能沉淀到加样孔中)。
15. 将离心吸附柱置于一个新的1.5mL塑料离心管中,加入30-50μL 65-80℃预热的DNA洗脱液,室温放置2分钟。常温的DNA洗脱液也可以用于洗脱,但产量稍微有所降低。
16.室温12000~15000g离心1分钟,离心管底溶液即mtDNA。
17. 由于本公司离心吸附柱结合DNA能力较强,如果再加30-50μL DNA洗脱液到离心吸附柱中,往往还能洗脱下很多mtDNA(相当于次洗脱的20-30%),但注意不要使用上步得到的mtDNA溶液来洗脱。
18. 12000~15000g离心1分钟,离心管底溶液即线粒体DNA。每107个动物细胞一般能得到100ng左右的mtDNA,每克组织一般能得到3-5μg mtDNA。如果DNA需要浓缩,可以使用本公司的核酸浓缩剂。
19. 由于DNA机械断裂,电泳时DNA可能不呈现专一的带,但此mtDNA溶液可以直接用于PCR。下列是公司正热销的产品：
/酵母细胞β-半乳糖苷酶活性滤膜染色试剂盒20次蛋白酶（枯草杆菌）
小量/酵母细胞基因组DNA纯化试剂盒20次肝素钠
中量/酵母细胞基因组DNA纯化试剂盒10次链脲佐菌素
大量/酵母细胞基因组DNA纯化试剂盒10次胸腺嘧啶
裂解液IX：/酵母细胞裂解液50次2′-脱氧腺苷-5′-三磷酸三钠盐
裂解液IX：/酵母细胞超强裂解液20次2′-脱氧胸苷-5′-二磷酸三钠盐
/酵母细胞可溶性总蛋白制备试剂盒20次羟乙基-β-环糊精
/酵母细胞可溶性总核蛋白制备试剂盒20次亚硝钴钠
/酵母细胞浆可溶性总蛋白制备试剂盒20次萘酚AS-TR乙酸酯
/酵母细胞壁可溶性总蛋白制备试剂盒20次钨酸银
/酵母细胞壁完全可溶性总蛋白制备试剂盒20次大叶茜草素
/酵母细胞细胞壁分离试剂盒20次槲皮素-3-O-β-D- 葡萄糖
/酵母细胞染色质沉淀分析（CHIP）试剂盒20次石斛碱
/酵母细胞染色质沉淀分析（CHIP）完全试剂盒20次五味子（北五味子）
（包括抗体）山药
巨大芽孢杆菌染料法qPCR试剂盒phospho-APP(phospho Thr668) /FITC 荧光素标记兔抗人、大、小鼠磷酸化APP淀粉样肽前体蛋白（p-APP Thr668）抗体IgG对甲酸甲酯 99%
APP695/770 /FITC 荧光素标记淀粉样肽前体蛋白抗体IgG邻 98%
APPL1/FITC 荧光素标记抗衔接因子蛋白含pH域磷酸酪氨酸结合域和亮氨酸拉链基元1抗体IgG赤霉素 >90% (HPLC)
APS/FITC 荧光素标记兔抗人、大、小鼠APS抗体IgG赤霉素 ≥96% (HPLC)
APS(Ser598)/FITC 荧光素标记磷酸化APS抗体IgG赤霉素 分析标准品
AQP1/FITC 荧光素标记水通道蛋白-1抗体IgG赤霉素 植物培养级，≥96% (HPLC)
AQP-2/FITC 荧光素标记水通道蛋白-2蛋白抗体IgG6-苄氨基嘌呤 99%
AQP-3/FITC 荧光素标记水通道蛋白-3抗体IgG4-溴吲哚 98%
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