操作流程:
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
产品特点：
1、公司产品仅用于科研不需要单独纯化线粒体，柱式法纯化，操作简单快捷。
2、得到的mtDNA可以直接用于PCR和酶切。
3、每107个动物细胞一般能得到100ng左右的mtDNA，每克组织一般能得到3～5μg mtDNA。
注意：本产品只适合于动物材料，不适合于植物材料，因为植物线粒体DNA一般都十分巨大,非常难提。
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产品名称
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TLR2受体染料法荧光定量PCR试剂盒
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规格
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50次
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货号
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FS-01P99005
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产品组成:
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成分
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规格
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溶液A
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13ml
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溶液B
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13ml
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溶液C
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18ml
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离心吸附柱
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50套
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通用洗柱液
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50ml
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DNA洗脱液
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10ml
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说明书
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1份
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使用方法:
一:培养细胞预处理
1. 用自备的0.25%胰酶消化液处理约107个培养细胞,离心收集后弃上清。
2. 用PBS或TBS等缓冲液洗涤细胞两次,离心得到的细胞沉淀直接用于mtDNA提取。
二:组织细胞预处理
3. 用剪刀将1g新鲜的动物组织剪碎(芝麻大小*),转移到1.5mL塑料离心管中,用于mtDNA提取。注意:*不要使用冻存的动物组织,因为冻凝过程中形成的冰晶会将线粒体刺破,使其DNA释放出来被胞浆中的DNA酶降解,影响回收率。
三:血液预处理
4. 将3-5mL抗凝外周血静置30分钟或低速离心5分钟,取白细胞层。
5. 用自备PBS洗涤白细胞两次,得到的白细胞沉淀用于mtDNA提取。
柱式动物线粒体DNA提取试剂盒(PCR级)四:mtDNA提取
5.在细胞沉淀或剪碎的组织中加入250μL冰浴的溶液A,充分吹打分散。如果是剪碎的组织,不要等成块的组织溶解即可继续下步操作。
6. 加入250μL常温的溶液B(如果溶液B有沉淀,用前须37℃加热溶解后冷却到室温方可使用),温和反复颠倒混匀10次。千万不要剧烈振荡。
7. 冰上放置6-8分钟。注意不要超过8分钟。
8. 加入350μL冰浴的溶液C,温和混匀4-6次,可见白色沉淀物产生,然后放冰上放置20-25分钟。
9.室温12000~15000g离心10分钟,小心将上清液转移到离心吸附柱中。由于此时的溶液比重较大,有时候出现沉淀漂浮是正常现象,取上清时避开漂浮的沉淀即可。
10. 静置5分钟以让DNA与离心吸附柱充分结合,此步十分重要。
11.室温12000~15000g离心1分钟,弃收集管中的废液。
12. 加入500μL的通用洗柱液,室温12000~15000g离心1分钟,弃收集管中废液。
注意:通用洗柱液中含乙醇,用后需要将盖拧紧存放,否则乙醇会挥发。
13. 重复上步1次。
14.室温12000~15000g离心1分钟,甩干残留液体。此步不能省略,否则残留乙醇会影响DNA的后续使用(如DNA上样时不能沉淀到加样孔中)。
15. 将离心吸附柱置于一个新的1.5mL塑料离心管中,加入30-50μL 65-80℃预热的DNA洗脱液,室温放置2分钟。常温的DNA洗脱液也可以用于洗脱,但产量稍微有所降低。
16.室温12000~15000g离心1分钟,离心管底溶液即mtDNA。
17. 由于本公司离心吸附柱结合DNA能力较强,如果再加30-50μL DNA洗脱液到离心吸附柱中,往往还能洗脱下很多mtDNA(相当于次洗脱的20-30%),但注意不要使用上步得到的mtDNA溶液来洗脱。
18. 12000~15000g离心1分钟,离心管底溶液即线粒体DNA。每107个动物细胞一般能得到100ng左右的mtDNA,每克组织一般能得到3-5μg mtDNA。如果DNA需要浓缩,可以使用本公司的核酸浓缩剂。
19. 由于DNA机械断裂,电泳时DNA可能不呈现专一的带,但此mtDNA溶液可以直接用于PCR。下列是公司正热销的产品：
果菜纤维素酶解法定量检测试剂盒10次T4 RNA连接酶
食物纤维素酶解法定量检测试剂盒10次谷胱甘肽过氧化物酶
谷类纤维素酶解法定量检测试剂盒10次纤维蛋白（人血）
麦子纤维素酶解法定量检测试剂盒10次乙二醇双（2-氨基乙基）四乙酸四钠
豆类纤维素酶解法定量检测试剂盒10次乙二四乙酸二钠镁盐
酒类氨比色法定量检测试剂盒20次腐
饮料氨比色法定量检测试剂盒20次硫酸铝铵
食物氨比色法定量检测试剂盒20次重硫酸铵
饲料氨比色法定量检测试剂盒20次仙茅苷
化妆品氨比色法定量检测试剂盒20次特女贞苷
氨待测样品处理试剂盒猪牙皂
酒类氨一步法定量检测试剂盒20次乌贼墨
饮料氨一步法定量检测试剂盒20次氨丁三醇
食物氨一步法定量检测试剂盒20次DL-苯丙氨酸
饲料氨一步法定量检测试剂盒20次L-赖氨酸甲酯盐酸盐
TLR2受体染料法荧光定量PCR试剂盒CKMT2/FITC 荧光素标记肌酸磷酸激酶2抗体IgG1,1'-双(二苯基膦)二茂铁 97%
CKIP-1/FITC 荧光素标记酪蛋白激酶2相互作用蛋白1抗体IgG2-溴-3-辛基噻吩 97%
CKLFSF2(human)/FITC 荧光素标记人类新因子/趋化素样因子超家族成员2抗体IgG3-溴噻吩 97%
CLCA4/FITC 荧光素标记钙激活氯离子通道4抗体IgG2-溴-3-甲基噻吩 99%
CLDN1/FITC 荧光素标记紧密连接蛋白1抗体(C端)IgG1,4-双(二苯膦基)丁烷 96%
CLDN1/FITC 荧光素标记紧密连接蛋白1抗体IgG双(三苯基膦)氯化镍(Ⅱ) 98%
ocludin-5/FITC 荧光素标记紧密连接蛋白-5抗体IgG[1,3-双（二苯膦基）烷]二氯化钯 Pd 18%
CLDN3/Claudin 3/FITC 荧光素标记紧密连接蛋白3抗体IgG2-溴芴 97%
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