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A-Hc2206-20 次
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pBM26 Toposmart Cloning Kit（gateway系统入门 TOPO克隆载体）
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pBM26 Toposmart Cloning Kit（gateway系统入门 TOPO克隆载体）-20℃保存
产品介绍：
利用痘苗病毒的拓扑异构酶I(Topoisomerase I)的切割再连接的特点将PCR产物定向克隆到线性化的pBM26载体中。适用于克隆由Pfu、sPfu、KOD、Xerox、Phusion和Q5等高保真DNA聚合酶扩增的平末端PCR产物。pBM26载体类似于invitrogen公司的pENTR/D-TOPO入门载体，具有attL1和attL2，为gateway系统中的入门载体。引物M13F(-21)r和M13R可用于菌落PCR和测序鉴定。
产品特点：
(1) 连接反应仅需 5 分钟。 (2) 只适合平末端 PCR 产物的快速、高效、定向克隆。 (3) 载体采用了新的制备工艺，零背景，无需蓝白斑筛选 (4) 可在基因的 C 端中融合 Flag 标签序列。 (5) 载体为卡那霉素抗性。
注意事项：
(1) 引物要求：PCR 引物 5’端不能进行磷酸化修饰，普通商业化引物即可。上游引物的 5’端添加 CACC 四个碱基（CACC 为真核表达所必需的Kozak 序列）。如果目的蛋白需要在 C 端带 FLAG 标签，下游引物则需要去掉基因本身的终止密码子（3 个碱基），目的蛋白的翻译终止由 FLAG 标签的终止密码子 TAA（位于 Xho I 酶切位点前）来实现。 (2) DNA 聚合酶：选用 Pfu、sPfu、Phusion、Q5、KOD 和 Xerox 等高保真 DNA 聚合酶用于 PCR 扩增。 (3)连接时间：5-15 分钟，一般为 15 分钟。 (4)连接温度：室温 (22℃-30℃)，可使用PCR仪控温。*佳反应温度为25℃。若片段有高GC等复杂结构，可在37℃反应。 (5)产物要求：为保证PCR产物完整，建议72℃后延伸5-10分钟。连接前使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的质量和纯度，如PCR产物为非单一性条带，目的片段一定要切胶回收。如PCR产物为单一条带，无引物二聚体，可以取1-3?l的PCR产物直接连接。但若扩增模板为质粒DNA，应注意质粒的抗性。由于pBM26载体为卡那抗性，以氨苄抗性的模板质粒扩增的PCR产物直接连接后的产物可涂布在卡那抗性的LB平板上。以卡那抗性的模板质粒扩增的PCR产物应切胶回收后再连接。 (6)片段用量：胶回收的DNA片段一般使用量为50-100ng。对照片段为5’端带CACC四个碱基的全长EGFP基因的平末端产物。 (7)在M13F(-21)和M13R引物干粉管中加120?l**水即为5?M浓度的引物。
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