用于 ELISA 检测的样品处理

采集样品时的主要考虑因素

• 血清： 采集全血后，在室温下放置 1 小时或在 2-8°C 下储存过夜。将样品在 2-8°C 下以 1000× g 离心 20 分钟，然后收集上清液进行检测。
• 血浆：考虑到抗凝机制和下游应用，选择必要的抗凝剂。例如：
• EDTA（乙二胺四乙酸）：通过结合钙离子防止凝血，适用于免疫学测定和细胞计数。
• 肝素：通过抑制凝血酶和凝血因子来防止凝血，是生化测定和蛋白质分析的理想选择。
• 柠檬酸钠：适合用于凝血实验，因为它能结合钙离子。

以下是使用 EDTA 的示例：使用真空采集针和无菌管采集新鲜血液，使用 EDTA-Na₂ 作为推荐的抗凝剂。在 2-8°C 下以 1000× g 离心样品 30 分钟内离心 15 分钟，并收集上清液进行检测。

• 细胞培养上清液：将收集的上清液在 2-8°C 下以 1000× g 离心 20 分钟，以去除颗粒和细胞碎片。收集上清液进行测试。

• 组织匀浆：用预冷的 PBS（0.01M，pH=7.4）冲洗组织以去除残留的血液，称量组织，然后将其切碎。
  将切碎的组织加入具有适当体积 PBS 的玻璃匀浆器中（通常使用 1：9 w/v 比率）。
  在冰上匀浆组织，并通过冻融或超声处理进一步破坏细胞。
  将匀浆在 2-8°C 下以 5000× g 离心 5-10 分钟，然后收集上清液进行检测。

• 细胞裂解物：用冷 PBS 洗涤贴壁细胞，然后用胰蛋白酶消化它们。以 1000×g 离心 5 分钟收集细胞，然后用冷 PBS 洗涤 3 次。对于每 10^6 个细胞，添加 150-200 μL PBS（必要时加入蛋白酶抑制剂），通过冻融或超声处理裂解。将裂解液在 2-8°C 下以 1500×g 离心 10 分钟。 收集上清液进行测试。

• 条件培养基：在完全生长培养基（含血清）中将细胞生长至所需的汇合度。取出生长培养基，用温热的 PBS 洗涤细胞数次。更换为无血清培养基，并将细胞孵育 1-2 天。收集培养基并在 4°C 下以 1500 rpm 离心 10 分钟。上清液可用于检测。
  
• 唾液：在至少 30 分钟不进食、不饮水或不刷牙后收集唾液。将样品在 2-8°C 下以 4000× g 离心 10 分钟，以去除杂质并收集上清液进行检测。

• 尿：在无菌管中收集中游晨尿，在 2-8°C 下以 1000× g 离心样品 15-20 分钟以去除碎片，并收集上清液进行检测。

• 粪便：将样品与 PBS（0.01M，pH=7.4）以 9 mL/g 的比例混合，在冰上摇动 15 分钟，然后在 2-8°C 下以 5000× 离心 5-10 分钟。 收集上清液进行测试。

• 骨髓：使用抗凝剂，并在采集后 30 分钟内在 2-8°C 下以 1000× g 离心 15 分钟。收集上清液进行测试。

• 贫血小板血浆：使用 EDTA、肝素或柠檬酸盐作为抗凝剂收集血浆。收集后 30 分钟内以 1000× g 离心 15 分钟。在 2-8°C 下，对 10,000 × g 血浆进行额外离心 10 分钟，以去除血小板。上清液可用于检测。

• 母乳：将样品在 2-8°C 下以 1000× g 离心 15 分钟。 收集水性组分并重复此离心步骤共 3 次。然后可以使用上清液进行检测。

样本收集笔记

1. 采集血样时应尽可能避免溶血。
2. 采集抗凝全血后，轻轻倒置试管以确保完全抗凝，防止部分血液未与抗凝剂接触而导致凝血。
3. 在收集组织和细胞提取物样品时，不建议使用市售裂解缓冲液。裂解缓冲液中的表面活性剂可能会影响分析物的天然构象，可能导致测量结果显著减少或假阴性。此外，由于引入了一种新的溶剂，潜在的基质干扰是不确定的，这可能会增加背景水平并影响测量准确度。
4. 避免使用高脂血症样本。高脂肪样品含有脂质，不是均质溶液。如果直接应用，它们可能会干扰抗原抗体结合，从而影响测量准确性。
5. 如果要在一周内检测样品，请将其储存在 2-8°C 下。 如果不能及时进行检测，请根据使用量将样品分装，并储存在 -20°C 或 -80°C 下，以避免重复冻融循环。

特别提示：导致样品溶血的原因以及如何避免

在样品处理中，溶血是指红细胞破裂，将血红蛋白释放到血清或血浆中。溶血可由各种物理、化学和毒性因素引起。在体外，机械搅拌或低温冷冻会导致溶血。

溶血发生后，内源性 HRP 酶和血红蛋白的过氧化物酶样活性可导致 ELISA 中不受控制的非特异性染色，影响结果的准确性。如果样品轻微溶血，建议在与标准品孵育后洗涤板 1-3 次，以尽量减少干扰。如果发生严重溶血，建议收集新样本。

为避免溶血影响检测结果，确保静脉穿刺压力不要太高，避免采集过小的血液，轻拿采集的血样避免剧烈摇晃，不要以过高的速度离心，及时将采集的全血加工成血清/血浆，避免冻融全血。如果采血需要麻醉，请使用不会引起溶血的麻醉剂。