标签： 限制性内切酶 消化 DNA
影响限制性内切酶反应的因素很多。DNA制品中的污染均能抑制酶切活性。这种抑制可通过增加酶作用单位数、增大反应体枳以稀释可能的抑制剂或延长反应时间来加以克服。
实验方法
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实验方法原理
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进行限制酶切割反应只需简单地将酶和DNA样品放在合适的反应缓冲液温育，其中DNA和酶的量、缓冲液的离子强度、温育温度和时间都依具体的反应而改变。
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实验材料
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DNA
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试剂、试剂盒
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TE 酶切缓冲液 EDTA
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仪器、耗材
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电泳仪
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实验步骤
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1. 混合下列溶液于一个无菌的微量离心管中
（1）x μl DNA
（2）2 μl 10×酶切缓冲液
（3）18-x μl H2O
（4）20 μl 的反应体积可以方便地用于聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分析。
（5）只要反应混合物中其他成分的比例保持一定，可增减待切割DNA的量和反应条件。
2. 加入限制性内切酶（1~5 U/μg DNA）在推荐的温度温育1 h （—般是37℃）。
3. 理论上，1 U 限制性内切酶在推荐的反应条件下，60 min 内可完全消化1 μg 纯化的样品。
4. 酶的体积应低于反应总体积的1/10，因为酶液中的可以干扰反应。
5. 加入5 μl 电泳加样缓冲液终止反应，进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳。
6. 反应也可通过加入0.5 μl 0.5 mol/l EDTA（终浓度为12. 5 mol/l） 以螯合镁离于而终止。
7. 很多酶再65℃温育10 min 可被不可逆灭活，有些不能在65℃热失活的酶在75℃温育15 min 也能失活。
8. 如果酶对热具完全抗性，可遍过酚抽提和乙醇沉淀或通过硅基质悬浮法来纯化DNA。
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