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DNA实验技术:哺乳动物中制备基因组DNA实验

发布时间:2017-07-08

标签: 哺乳动物 基因 DNA

在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性,为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA有107-9bp,可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取,常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞,随后用酚抽提而实现的。

实验方法
  • 制备DNA
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
1.  切下组织并立即剪成小块,置于液氮中冻结。
 
2.  将200 mg~1 g 的组织用预冷的研钵和研杵研碎,或用锤子将其捣为细粉末,每100 mg 组织用1. 2 ml 消化缓冲液悬浮。
 
3.  500 g 离心细胞5 min,弃上请。贴壁生长细胞先用胰酶消化。
4.  细胞用1~10 ml 冰冷的PBS重悬,500 g 离心5 min,弃上清,重复1次。
5.  用1体积 的消化缓冲液重悬细胞。
 
6.  将样品在盖紧的管中于50℃摇荡下温育12~18 h。
 
7.  用等体积的酚/氯仿/异戊酵抽提样品,1 700 g 离心10 min。
8.  如果样品溶解得不好, 再加1体积不含蛋白酹K的消化缓沖液,并重复离心。
9  如果在界面上有一层厚的白色物质,重复有机抽提,将上层(水溶液)转移至一个新管中。
 
10.  加入1/2体积7.5 ml 乙酸铵和2体积100%乙醉,1 700 g 离心2 min。
 

11.  用70%乙酵洗涤,晾干,沉淀用TE。

12.  缓冲液重新溶解,使终浓度在约1 mg/ml 左右

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