磷酸化蛋白的WB检测是信号通路研究中的经典方法。细节决定成败，在科研中更是如此，本文详细讲述了实际操作过程中应该注意的事项，分享出来方便大家学习。
1. 一定要在 lysis buffer 中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使 band 压出来也会很浅，结果也不可信。
2. 加一抗后*好 4 度过夜，保证抗体有充分的结合时间。因为磷酸化的蛋白只占总的蛋白量的极少部分。 二抗则室温 1 小时即可。
3. 磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。务必找专业的磷酸化抗体公司订购，像CST,Affinity等。
4. *好根据厂商的 protocol 来操作实验，这是实验成功的保证。
5. 抗体的稀释倍数也要适当。不同厂商也会有不同要求。
6. 研究完某一蛋白的磷酸化情况后*好也要研究一下该蛋白总的表达量。如压完 phospho-p38 抗体后，我会把相同的 membrane 做 strip 后再压 p38, 然后再 strip 一次，再压内标 actin 。
7. 做磷酸化蛋白 WB 时，除了目标蛋白的 band 以外，往往会出现非特异性的 band. 磷酸化抗体不好的话，甚至会压出非特异性的 band, 而没有你想要的 band, 所以压片以后，一定要根据 markers 比对一下，压出的 band 分子量是否正确。
8. 磷酸化蛋白 WB 时 backgroud 也往往较深，所以压片时间要适当，不能太长或过短，太长则 backgroud 太深盖住想要的那条 band, 时间过短则可能没有 band 或者 band 太浅。
9. 磷酸化蛋白 WB 时，要用TBST，不能用PBST。用 TBST 洗时也要注意一下，摇床的转速不要太快，洗的时间不要太长，孵育一抗和二抗之后分别洗 5min 3 次即可，宁愿 background 深一些，总比做不出来强得多 . 另外，洗的时候，*好不要把几张 membrane 叠在一起洗。
10. 正如第 5 点所说的 ,“研究完某一蛋白的磷酸化情况后*好也要研究一下该蛋白总的表达量 ”。这有两种方法，一是：相同的 sample 在不同的 well 中上样两次，可在相同的gel上，也可在不同的gel。其一压磷酸化蛋白，另一压该蛋白总的表达量（包括磷酸化和未磷酸化的该蛋白），甚至还可跑另一个 gel ，压内标。但是本人不建议如此做，因为这样比较时误差还是较大的。因此，比较公认的，本人也建议如此的方法，即：将原先结合上的磷酸化抗体及二抗用 strip solution 洗去，
11. 方法如下 :50 度水浴 30min 后，用 TBST 洗 5 分钟 ,3 次即可去除已孵育结合的抗体。许多人会建议 55 度水浴 30min。Strip solution 是用来去除已结合的抗体，但也会去除部分的蛋白，导致蛋白信号变弱。我本人经实验发现水浴时有时温度不稳定，温度定为 55 度时往往其温度容易超过，导致较多的蛋白也被去除，故建议温度设为 50 度 30min ，既能有效去除已结合的抗体，又比 55 度更能保护蛋白 .
12. Strip 时一定要注意： membrane 一定要完全泡在 strip solution 中（可用较硬的塑料膜封好），然后要完全浸入水中，使受热均匀 。这一点很重要，要不然，随后压出来的总蛋白也好，内标也好就会不均一，无法进行比较。我曾将同一张 membrane 用我提供的方法 strip 了 3 次，分别压不同的抗体（因为有时候蛋白分子量很接近），效果都不错。
13. 附个Stripping Buffer配方以供参考：
Mild stripping Buffer, 1 liter
15g Glycine
1g SDS
10ml Tween 20
Adjust pH to 2.2
Bring volume up to 1 L with ultrapure water.
磷酸化蛋白的WB检测注意细节磷酸化蛋白的WB检测注意细节
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