Mitochondria Isolation Kit for Cell and Tissue 组织/细胞线粒体分离试剂盒

Mitochondria Isolation Kit for Cell and Tissue 组织/细胞线粒体分离试剂盒

产品信息

运输和保存方法
冰袋运输。-20℃保存，有效期1年。
使用方法
1）样本处理
①组织匀浆：称取100-200 mg新鲜组织，PBS或生理盐水冲洗干净，滤纸吸干，用剪刀剪成非常小的碎块放入小容量玻璃匀浆器内。加入1-2.5mL冰预冷的试剂A，0℃冰浴研磨30-40次。
②培养细胞匀浆：消化细胞，PBS洗涤，800 g 离心5-10 min收集细胞。计数，每次提取需要1-5 × 107个细胞，加入1-2.5mL预冷的试剂A，重悬细胞，混匀，将细胞悬液转移到小容量的玻璃匀浆器，0℃冰浴研磨30-40次
2）将组织或细胞匀浆物转移到离心管，4 ºC，1000 g 离心5 min。【注】：细胞核、大的膜碎片、未裂解细胞等沉淀在管底。
3）收集上清液并转移到新的离心管。4 ºC，1000 g 再次离心5 min。弃沉淀。
4）将上清液转移到新的离心管。4 ºC，12,000 × g 离心10 min，离心后的上清含胞浆成分，可提取胞浆细胞，小心去除上清，沉淀即为分离得到的细胞线粒体。【注】：离心后的上清含胞浆成分，尽量除去上清。

5）往线粒体沉淀中加0.5ML试剂B重悬线粒体沉淀，4℃，1000g离心5min。

6）取上清，转移至新的离心管中，4℃12，000g离心10min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底。

7）用50-100UL试剂C或者合适的反应缓冲液重悬线粒体沉淀，立即使用或者-70℃保存

注意事项：

1. 为保证获得完整的线粒体，务必做到：全程低温操作；快速；在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞，这是制备线粒体的*关键环节。与组织块相比，培养细胞特别是贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁，因而要选用小容量玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上下研磨培养细胞。

2. 以离心力g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精que计算离心速度。3. 进行Western Blot和2D-胶电泳，可直接加入上样缓冲液裂解线粒体。 转速与离心力换算：     G＝1.11×(10-5)×R×[rpm]２ G为离心力，一般以ｇ（重力加速度）的倍数来表示； [rpm]２即：转速的平方； R为半径，单位为厘米。

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