蜡状芽孢杆菌的耐热性比野生型高

     本研究基于易错PCR技术的定向进化策略筛选热稳定性提高的突变体BFA，经过一系列的初筛、复筛获得了一株热稳定性提高的突变体D476N。突变体E. coli BL21(DE3)/pET-D476N表达在宿主E. coli BL21(DE3)中，经过硫酸铵沉淀、浓缩、纯化突变体重组β-淀粉酶；酶学性质和动力学参数测定发现，突变体D476N与野生型相比对底物的亲和性无明显变化，而对可溶性淀粉的催化活性有少许降低。突变体D476N在高温条件下能够保留较高的酶活，表明突变体D476N的耐热性比野生型有明显提高。

    为了阐明突变体D476N热稳定性提高的机理，对野生型和突变体D476N使用SWISSMODEL程序同源建模。以同源性高的蜡状芽孢杆菌晶体结构为模板(1j10.1A，PDB)模拟得到野生型和突变体D476N的三维结构。

     有研究发现，蛋白质表面的loop区域对蛋白质的稳定性有重要作用，如淀粉液化芽胞杆菌来源的突变体葡聚糖酶，通过定向进化-易错PCR筛选得到热稳定性显著提高的突变株，其共发生了7个氨基酸的取代，有5个位于蛋白质的loop区域。使用PyMol软件显示出生成的突变体D476N的结构模型和突变点的位置，发现突变后的氨基酸残基Asn476也位于蛋白质的表面loop上。

     根据蛋白质分子自由能(ΔG)和热稳定性呈负相关的关系，可以得知，野生型β-淀粉酶将476位的天冬氨酸替代为天冬酰胺后，导致β-淀粉酶的分子自由能由118.20降低为106.01 kcal/mol，下降了10.3%。这一结果为蛋白质热稳定性提高提供了有力的依据，同时也表明了蛋白质表面loop区域的氨基酸突变对稳定性的影响起到了显著的作用。