lucigen 49013-2 SUMO克隆表达系统简单介绍说明

③5秒钟定向克隆PCR扩增的基因

SUMO蛋白克隆表达系统使用表达工程技术，无酶重组克隆策略，将基因连入表达载体采用无缝连接。PCR扩增靶向基因，并在基因两侧加入18bp与载体互补的序列。不同于限制酶方法或无连接酶克隆方法，不需要进一步的对酶处理或PCR产物进行纯化。只需要简单的混合1µl未纯化的PCR反应产物和预处理好的pETite或 pRham N-His SUMO表达载体，立即转化化学感受态细胞即可完成（如图1）

④SUMO 载体包括:

1. 强启动子T7用于高效表达或鼠李糖启动子用于可调控的重组蛋白表达。
2. 利用N末端6×组氨酸 SUMO融合标签增加蛋白可溶性表达，并方便蛋白快速纯化。
3. 载体大小为2.5 kb，易于下游操作。
4. 专li的CloneSmart® 技术，增加克隆效率。

⑤使用SUMO蛋白标签使不可溶蛋白恢复可溶活性

我们使用T7或T7sumo克隆表达系统用于表达或纯化蛋白。大规模表达研究的一些结果是为了鉴定琥珀酸放线杆菌水解酶，如图3.zui初挑选了48个基因用于表达和克隆进pETite T7 C-His载体。大约这些克隆中的一半产生可溶性，具有活性的水解酶蛋白，而另外一部分是不可溶性的表达。产生非可溶性蛋白基因中五个被扩增并克隆进pETite SUMO载体，然后转化进HI-Control BL21(DE3)，其中四个恢复为可溶性，并产生活性（表1）。尽管标签移除对于水解酶活性没有必要影响，但是SUMO表达蛋白酶可以有效去除标签。

⑥切割 SUMO蛋白标签

IMAC纯化 N-His-SUMO 标签蛋白后, 标签部分可以被SUMO表达蛋白酶准确移除。SUMO表达蛋白酶识别SUMO结构而不是短的识别序列，所以可以在标签与靶蛋白间进行准确切割，不会进行脱靶切割。6xHis 标签的SUMO表达蛋白酶和切割的N-His-SUMO标签能够通过IMAC被分离并释放出靶向蛋白。

注意：盒子中包含的SUMO蛋白标签是一个特殊版本的SUMO，只能使用Lucigen的SUMO表达蛋白酶才能够进行切割。SUMO表达蛋白酶不能切割野生型的底物。因此，不推荐使用SUMO表达蛋白酶切割野生型的SUMO。