小动物行为学系统视频分析系统在创伤后应激障碍的临床症状中的应用

 创伤后应激障碍 ( post-traumatic  stress  disor- der，PTSD) 是种复杂的焦虑障碍。患者在经历了严重的创伤性事件后，表现出回避性行为，恐惧增强及后觉醒状态^［1］。PTSD 的病因复杂，其机制的探索先需要建立个良好的动物模型模拟PTSD 的特征，即: ①具有短期强烈的应激事件;②模拟 PTSD 患者的核心症状，即对创伤性线索的反应性增强，过度觉醒以及社会回避表现; ③症状可持续存在甚至随着时间而增强^［2］。单次延长刺激模型 ( single-prolonged stress，SPS) 能够较好模拟 PTSD 发病过程及患者出现的部分核心症状，如逐渐产生的焦虑行为和过度觉醒，因此日渐受到研究者的关注，并广泛用于 PTSD 的神经生物学机制研究^［3］。SPS 造模^［4］是个连续的过程，这种连续性应激可使动物对条件恐惧僵住反应增强，同时损坏其恐惧记忆的消退功能，*终导致动物对创伤无关的刺激做出过度的生理和行为反应^［4］。γ-氨基丁酸 ( γ-aminobutyric acid，GABA) 是**神经系统重要的抑制性神经递质，可以调节机体面对应激时的生理反应^［5］。GABA 受体包括离子型的 GABA_A 和 G-蛋白偶联的 GABA_B 受体两种亚型，均在焦虑调节中发挥重要作用^［6］。分子遗传学研究发现 GABA 系统和 PTSD 的发生具有关联性，例如，GABA β3 亚基 3 ＇端的微卫星序列的多态性和 PTSD 的发生率存在相关性^［7］。另有研究发现 PTSD 患者的脑内 GABA 水平降低^［8］。因此GABA 系统的功能异常可能参与 PTSD 的发生。海马是负责空间学习记忆的重要脑区，主要功能是将短期记忆固化为长期记忆以及空间记忆的形成。同时，大量研究表明海马也参与应激及情绪的调节^［3］。影像学研究发现 PTSD 患者的海马，同遭受应激但是没有 PTSD 症状的人相比显著缩小^［9］，提示海马的功能异常可能参与 PTSD 的发生。CA1 和CA3 是海马的重要亚区，CA3-CA1 突触传递在学习记忆和应激反应中发挥重要作用。但研究发现CA3 和 CA1 对应激的反应，如应激导致的长时程增强 ( long-term  potentiation，LTP) 及些基因的表达调节是不同的，这取决于应激的种类和应激时间^［10-11］。因此在本研究中我们将应用 SPS  作为 PTSD 的动物模型，验证 SPS 所导致的增强的焦虑性行为并观察其对海马 CA1 和 CA3 亚区 GABA_A 和 GABA_B 受体的蛋白表达量的影响。

1 对象与方法

1. 1 实验动物

雄性 Sprague-Daw ley  ( SD ) 大鼠，购��北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号: S ( 京) 2001 － 2003，体重平均在 200 ～ 220g。采用12 小时昼夜节律控制 (8: 00 － 20: 00 )。实验室湿度和温度均符合实验标准。实验开始，动物在动物房适应性饲养 7 d，自由饮水，进食。实验大鼠随机分为未造模组、SPS 造模 1 d 和SPS 造模 14 d 组，每组各 8 只。经过造模后，SPS 造模 1 d 和SPS 造模14 d 所剩动物分别为7 只和6 只。应用旷场和高架十字实验测试 3 组大鼠的焦虑程度; 行为学测试 24 h 后，断头取脑检测 CA3 和 CA1 脑区GABA_A 和 GABA_B 的表达情况。

1. 2 实验材料和试剂

小动物强迫游泳视频分析系统，; 电泳仪、电泳槽，; 大鼠束缚容器，;  高架十字迷宫，。抗兔GABA_A 抗体 ( Abcam，美国)，抗兔GABA_B 抗体 ，抗小鼠 β-Actin 抗体，辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠 IgG抗体，辣根过氧化物酶标记羊抗兔 IgG 抗体 。

1. 3 PTSD 模型的建立

成年SD 大鼠，在动物房适应性饲养7 d 左右.先使用硬质塑料盒 ( 使大鼠四肢及躯干束缚在瓶中，尾巴露在外面) 给予大鼠 2 h 的束缚，紧接着让其在 20 ～ 24 ℃ 水温进行 20 min 的强迫游泳， 之后休息15 min，*后用乙醚麻醉直至无抵抗。束缚期间温度和湿度都与正常饲养环境致，待应激结束后分笼放回动物房饲养。

    不同处理组间 CA3 脑区 GABA_A 受体和 GAB- A_B 受体表达差异有统计学意义，Post-hoc 分析发现，同未造模动物相比，造模 14 d 组大鼠 CA3 脑

3 讨 论

创伤后应激障碍的临床症状表现多样，主要是 患者在经历精神创伤性事件后数天至数月内发生的 创伤性经历再体验、情感麻木、回避行为和过度觉 醒导致的易激惹状态^［1］。建立效度好的动物模型 是研究 PTSD 发病机制的关键手段之，但目仍无个被广泛接受的动物模型。之的研究已经构 建了些动物模型如电击模型，捕食者场景模型以 及边缘系统点燃模型等^［2］。虽然这些模型在定 程度上模拟创伤性应激，但是对于些 PTSD 的关键特征，如由创伤性应激导致的时间依赖性增强的 敏感化表现并不能很好的模拟^［4］。有研究表明，

Liberzon 等建立的 SPS 动物模型可较好地模拟PTSD 患者出现的恐惧记忆、焦虑反应增强、警觉性明显增高及相关神经***改变^［4］。同时，经历了 SPS 的动物还表现出恐惧记忆消退受损，进而导致动物对与创伤无关的刺激做出过度的生理和行为反应。因此，SPS 动物模型已经成为目常用的PTSD 动物模型之^［3］。本研究采用SPS 动物模型，发现动物经历 SPS 造模后第 1 天的焦虑样行为无显著性变化，而在第 14 天的焦虑样行为显著升高，验证了 Serova 等多个课题组关于 SPS 可以导致延迟性发生的焦虑反应增强和警觉度增高的现 象^［14］，表明 SPS 模型具有好的效度和重复性。

有研究指出，海马在调控应激和焦虑样行为中发挥着重要作用^［15］。长期束缚应激导致大鼠海马CA3 亚区神经元树突萎缩，动物在高架十字迷宫开放臂中的探索减少^［16］。机体在遭受应激时 CA3- CA1 的 LTP 受损同时伴随有 BDNF 的降低^{［10，17］}。临床研究发现，创伤后应激障碍患者对环境性线索 的识别受损，提示海马功能受损可能在 PTSD 发病中发挥着重要作用。GABA 是神经系统中重要的抑制性递质，可以防止神经系统的过度激活及谷氨 酸的过度释放^［18］。动物实验发现慢性应激可导致 海马 CA1 和 CA3 区 GABA 能神经元数量降低^［19］， 慢性暴露于应激水平的肾上腺皮质**导致海马GABA_A 受体亚基表达异常，但是不同亚基表达变化在 CA1 和 CA3 区呈现不同的模式^［11］。临床发现，GABA  β3 3＇端的微卫星序列的多态性和 PTSD的发生率存在相关性^［7］。本研究发现 SPS 造模 14 d 后海马 CA1 和 CA3 亚区中的 GABA_A 和 GABA_B 蛋白表达均显著性降低，这和其焦虑样行为出现的 时间点相符，这和人关于机体遭受应激 CA3- CA1 的 GABA 递质传递调控异常的研究相致， 并进步提示海马的 GABA 受体异常表达可能调控 PTSD 部分症状发生，如增强的焦虑及警觉度。本研究的不足之处是未对 SPS 导致的其他PTSD 样行为特征如恐惧记忆的形成和消退的影响， 及PTSD 样行为和 GABA 受体的表达降低进行因果关系探索。因此，后的研究中我们将对 CA1  和CA3 脑区 GABA 受体进行调节， 以便观察海马CA1 和 CA3 脑区 GABA 受体的异常表达是否调控了大鼠 PTSD 样行为的产生。