检测未知抗体的间接法

ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。以下详细介绍未知抗体的间接法。

用于检测未知抗体的间接法：　　　

1、用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。

2、次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。同时做空白、阴性及阳性孔对照于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（抗抗体）0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,*后一遍用DDW（超纯水）洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

3. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

4. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

5. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。