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产品及特点：
近几年，H5N8 亚型高致病性禽流感疫情相继在欧洲、亚洲和大洋洲部分地区的 14 个国家暴发。首先于 2014 年 1 月在韩国引起疫情暴发，导致蛋鸭产蛋率下降(60%)，死亡率上升。随后迅速席卷了亚洲、欧洲和北美洲。2016 年 10月底以来，欧洲再次暴发了 H5N8 亚型高致病性禽流感疫情，且传播迅速，危害严重。由于家禽与人的接触关系密切，H5N8 必然会传染给人类。本产品是根据PCR 原理开发的禽流感检测的试剂盒。
1. 一站式，用户不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。
2. 根据甲型流感(禽流感)病毒H5N8亚型的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。
3. 灵敏度可以达到 1000 拷贝/反应。
4. 使用一管式 RT-PCR 技术，RT 和 PCR 两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的 RT-PCR。
6. 本产品只能用于科研，不能用于临床。
规格及成分：
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编号 |
成分 |
规格 |
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试剂一 |
5×双酶一管式 RT-PCR Buffer |
200 μL(橘黄盖) |
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试剂二 |
MMLV-Taq Mix |
75 μL(红盖) |
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试剂三 |
超纯水 |
1 mL(亮黄盖) |
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试剂四 |
甲型流感(禽流感)病毒H5N8亚型 RT-PCR 引物混合液 |
100 μL(白盖) |
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试剂五 |
甲型流感(禽流感)病毒H5N8亚型 RT-PCR 阳性对照(1×10E8/μL) |
50 μL(黄盖) |
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试剂六 |
使用手册 |
1 份 |
运输及保存：
低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。收到货后阳性对照需要跟其他成分分开放置，因为其容易污染其他成分，造成假阳性。
自备试剂：
样品 RNA。
甲型流感(禽流感)病毒H5N8亚型RT-PCR试剂盒
使用方法：
一、样品 DNA 的制备：
1. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 甲型流感(禽流感)病毒H5N8亚型 PCR阳性对照的 1000 倍稀释液作为制备的阳性对照。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品 RNA。
2. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。可以选购本公司的柱式病毒 RNAout。
二、设置RT- PCR 反应(20μL 体系)：
3. 如果有 N+2 个样品，则标记 N+4 个 PCR 管(额外增加的两个管一个是RT-PCR 阳性对照，另一个是 RT-PCR 阴性对照)并按照下表在 PCR 管中加入下列成分：
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成份 |
N+2 个 样品管 |
RT-PCR 阴性对照 |
RT-PCR 阳性对照 |
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5×双酶一管式RT-PCR Buffer |
各 4 μL |
4 μL |
4 μL |
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甲型流感(禽流感)病毒H5N8亚型 RT-PCR 引物混合液 |
各 2 μL |
2μL |
2μL |
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N+2 个制备的 RNA 样品 |
各 12.5μL |
-- |
-- |
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超纯水 |
-- |
12.5μL |
-- |
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甲型流感(禽流感)病毒H5N8亚型 RT-PCR 阳性对照的 1000倍稀释液 |
-- |
-- |
12.5μL |
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MMLV-Taq Mix |
1.5 μL |
1.5 μL |
1.5 μL |
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过程 |
温度 |
时间 |
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逆转录 |
42℃ |
30 min |
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预变性 |
95℃ |
5 min |
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PCR 反应35个循环 |
95℃ |
30 sec |
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58℃ |
30 sec |
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72℃ |
20 sec |
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延伸 |
72℃ |
7 min |
5. 琼脂糖电泳检测扩增效果。如果阴性对照有扩增产物或阳性对照无扩增产物，则说明实验失败，需要分析实验失败的原因。只有在阴性对照没有扩增产物、阳性对照必须有预期条带出现，才有必要分析样品的实验结果，如果有预期片段大小的扩增产物则为阳性，如果无则为阴性。