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第5年
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产品详情
简单介绍：
T7转录试剂盒本试剂盒是基于 T7 RNA 聚合酶的 RNA 体外转录试剂盒，它利用含有T7 启动子的模版 DNA，以 NTP 为底物，从 T7 启动子下游开始合成与模版DNA 中一条链互补的RNA，简单快速获得大量的 RNA 分子。
详情介绍：
产品特点
本试剂盒是基于 T7 RNA 聚合酶的 RNA 体外转录试剂盒，它利用含有T7 启动子的模版 DNA，以 NTP 为底物，从 T7 启动子下游开始合成与模版DNA 中一条链互补的RNA，简单快速获得大量的 RNA 分子。
它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需提供含 T7 启动子的 DNA 模板即可以进行体外转录实验不需要单独准备每一个成份。
2. 单溶液预配液，减少加样次数，避免了操作误差，增加了可重复性。
3. 模版 DNA 可以是线性化的质粒 DNA，也可以是 PCR 扩增产物。
4. 可以合成的 RNA 的佳长度在 20nt 到 2000nt 之间。
5. 产品配方经过精心优化，每 1μg DNA 模版可以合成2～6μg RNA。
6. 得到的 RNA 可以用于 RNA 结构研究、核酶生物化学、体外翻译、RNA蛋白质相互作用、反义技术、SELEX 技术和 RNA 干扰（RNAi）等实验。
7. 本试剂盒足够 50 次 20μL 体系的体外转录实验并且只能用于科研。。
成分规格
产品组成
T7 转录预配液 2× 0.5 mL
RNase-free 水 水 1mL
保存条件
-20℃可保存 12 个月
使用方法
自备试剂
Tris 饱和酚、氯仿、RNase-free 75%乙醇。
制备 DNA 模板
制备 DNA 模板
（本试剂盒不含所需试剂，此处信息仅供参考）PCR 片段和质粒 DNA 都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点。
a)必须使用线性化的 DNA。如果是质粒 DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。
b) 需要转录的 DNA 序列的上游必须有 T7 启动子。如果模板是PCR产物，则可以在设计引物时将 T7 启动子序列 5′TAA TAC GAC TC A CTA TAGGG3′加上。如果是将 DNA 片段克隆到载体上，则需要选择有 T7 启动子的载体，并且克隆位点必须位于 T7 启动子下游。
b) 需要转录的 DNA 序列的上游必须有 T7 启动子。如果模板是PCR产物，则可以在设计引物时将 T7 启动子序列 5′TAA TAC GAC TC A CTA TAGGG3′加上。如果是将 DNA 片段克隆到载体上，则需要选择有 T7 启动子的载体，并且克隆位点必须位于 T7 启动子下游。
c) 需要转录的 DNA 序列的下游端不要是 3′突出。如果是3′突出（比如选择了 Pst I 来线性化质粒），则用 T4 DNA 聚合酶修平。
d) 必须保证 DNA 模板中没有 RNase。由于提取质粒 DNA 的过程中一般要使用大量的 RNase A，因此质粒 DNA 一般都有严重的 RNase A 污染，所以在用作模板前，采取胶回收的方法纯化质粒 DNA。并且加入少量总RNA 一起保温然后电泳检测 RNA 是否被降解，以此来判断纯化的 DNA 模板是否有残留RNase A。如果有 RNase 污染，则必须反复酚氯仿抽提去除残留的RNase 然后再乙醇沉淀质粒DNA。
体外转录反应
1. 如果有 N 个样品，强烈建议做一个阴性对照，故共设置N+1 个反应，这样一起并排电泳时容易判断哪个条带是模板 DNA，哪个条带是转录扩增得到的RNA。在N+1 个 RNase-free 的塑料离心管中，在室温下（不是在4℃下）按次序加入下列成分，T7 转录预配液容易产生结晶，沉淀一定要握在手中直到结晶彻底溶解并摇匀后方可使用。
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成分 |
N 个样品管 |
阴性对照管 |
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DNA 模板 |
100-500ng左右的PCR片段或线状质粒 |
－ |
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2×T7 转录预配液 |
各10μL |
10μL |
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RNase-free 水 |
至20μL |
至20μL |
注：此为 20μL 反应体系的用量，对其他反应体系，各成分的用量可以按比例增减。本产品的2×T7转录预配液已经含有 NTP。如果需要标记 RNA 探针或制备带帽 RNA，则需要订购NTP 分开的试剂盒。
2.37℃保温 1-2 小时(注意：延长保温时间并不能大幅提高产量。
3. 加入 2μL 自备的 500mM 的 EDTA 溶液灭活 T7 RNA 聚合酶。
4. 取 5μL 电泳，此时加上一个 DNA 模板做电泳对照。电泳时比阴性对照多出的条带就是转录扩增得到的 RNA，由于合成的 RNA 长度不均匀，即使长度均匀，但由于自身形成发夹结构，泳动速度也不一致，所以电泳所得RNA条带一般都不是清晰单一条带，而是比较弥散的电泳条带。但由于RNA 是单链，分子量比同样长度的 DNA 小一倍，因此 RNA 一般比其双链 DNA 模板电泳速度更快。
5. 定量，可以用自备的单链 RNA 定量试剂盒检测浓度。不推荐使用电泳定量。使用本试剂盒时 1μg 的 DNA 模板一般可以合成 2～6μg 的RNA。
6. 得到的 RNA 可以放 80℃保存。如需去除 DNA 模板，请按下面步骤操作。
去除 DNA 模板（所需试剂需要另购）
1. 在 20μL 体积的体外转录体系中加入 2μL 的 10×DNase Buffer 和1μL自备的RNase-free DNase 3～5U/μL。
2. 37℃保温 30 分钟。
3. 补 RNase-free 水到 100μL。增加体积可以减少样品的丢失。
4. 用自备的等体积 100μL 的 Tris 饱和酚和氯仿震荡混匀后14000g 离心3 分钟将上清转移到新的离心管中。此步去除 DNase 和 RNA 聚合酶。
5. 加自备的 200μL 无水乙醇和 10μL 3M 的乙酸钠溶液（pH5.2），振荡后14000rpm离心 20 分钟，RNA 形成沉淀，弃上清。
6. 在沉淀中加入 1mL 75%乙醇，震荡 10 秒后 14000g 离心5 分钟，弃上清。
7. 短暂离心数秒，用枪头吸弃上清。不要丢失沉淀。
8. 晾干，所得沉淀即体外转录所得的 RNA。去除 DNA 模板也可以用 PCR 产物纯化回收试剂盒。
问题解答
1. 没有RNA产物。常见原因是模板有RNase污染，可用纯化好的RNA跟模板DNA一起保温再电泳，再检测其是否有污染。
2. RNA产量低。常见的原因是DNA模板。在转录序列的一个和二个碱基都是G，在前14个碱基内避免有U存在。
3. RNA长度比预期的短。可能是模板序列中有T7 RNA聚合酶的终止序列。
4. RNA长度比预计的长。T7 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一样，有不依赖于模板的加尾功能，有一半的RNA可以带一个或两个碱基的尾巴。如果RNA长度比预计的长很多，使用的模板又是质粒DNA，则可能是质粒线性化不彻底。
5. 5′单磷酸还是三磷酸?如果使用GTP，则得到的RNA是三磷酸，体外转录时如果保温时间太长（如12小时），则有50%的三磷酸会变成单磷酸。如果在转录体系中加入GMP，则T7 RNA聚合酶将优先使用GMP，所得RNA产物中5'端是单磷酸的比例将大大增加。6. 用体外转录试剂盒如何得到带帽RNA?需加入带帽NTP类似物即可。