夹心 ELISA 测定两层抗体（捕获抗体和检测抗体）之间的抗原。目标抗原必须包含至少两个能够结合到抗体的抗原表位。单克隆或多克隆抗体均可在夹心 ELISA 系统中用作捕获抗体和检测抗体。单克隆抗体识别单一表位，可对抗原中微小差别进行定量检测。多克隆抗体通常用作捕获抗体以沉降尽可能多的抗原。
夹心 ELISA 省去了分析之前的样品纯化步骤，而且提高了分析灵敏度（灵敏度比直接或间接 ELISA 高 2-5 倍）。
夹心 ELISA 程序可能难以优化，应使用已测试的匹配抗体对。这样可确保抗体检测靶蛋白上的不同表位，而不会干扰其它抗体结合。我们不能保证我们的抗体可用于夹心 ELISA，除非它们已经过专门的测试。
双抗体夹心法是检测抗原*常用的方法，操作步骤如下：
1、将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。
2、加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
3、加酶标抗体：使固相免yi 复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
4、加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。