Ct值定义:
阈值循环数 Threshold cycle (Ct) 也写作Cq值,荧光信号大于荧光阈值时PCR循环数。仪器软件通常将第3-15个循环的荧光值设为基线(baseline),是由于测量的偶然误差引起的。阈值(threshold)一般是基线的标准偏差的10倍。在实际操作中也可以手动调节。高于阈值的荧光信号被认为是真实的信号,用于定义Ct值。Ct会受到阈值的影响,每次试验由于样品和仪器的不同会导致基线不同,进而影响阈值和Ct值。
模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在一定线性关系,起始模板量浓度越高,Ct值越小;起始模板量浓度越低,Ct值越大。PCR循环在到达Ct值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期(对数期),此时微小误差尚未放大,Ct值的重现性较好,即相同含量的初始模板,得到的Ct值是相对稳定的。
Ct值不是恒定不变的,可以受到不同样品、不同仪器的影响,即使相同的样品在相同的仪器上重复2遍,Ct值也会存在差异。
与Ct值有关的参数:
标准曲线Standard curve:模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代Ct值。
相关系数Correlation coefficient (R^2) :反映了标准曲线的线性,通常要求>0.99。
扩增效率Efficiency (E): 通常要求在90%~110%。效率低于100%,是由于PCR反应中存在抑制因素;而高于100%可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。
斜率Slope :当扩增效率为100%时斜率为-3.32,当90%-110%时的斜率为-3.58 ~ -3.10。