逆转录酶是存在于 RNA 病毒体内的依赖 RNA 的 DNA 聚合酶。RT-PCR 实验中的逆转录酶需要具有以下三种活性：
1. 依赖 RNA 的 DNA 聚合酶活性：以 RNA 为模板合成 cDNA 的第1条链；
2. Rnase 水解活性：水解 Rnase 杂合体中的 RNA;
3. 依赖 DNA 的 DNA 聚合酶活性：以一条 DNA 链为模板合成互补的双链 DNA
在选择逆转录酶时，建议选择无 RNaseH①活性（RNaseH-）的逆转录酶。具有 RNaseH 活性的逆转录酶的 RNaseH 活性会与聚合酶活性竞争 RNA 模板与 DNA 引物（或 cDNA 延伸链）形成的杂合链，并降解杂合链中的 RNA 链。被 RNaseH 活性所降解的 RNA 模板不能再作为合成 cDNA 的有效底物，降低了 cDNA 合成的产量与长度。