ELISA实验开始前,各试剂均应平衡至室温(试剂不能直接在37℃溶解)。试剂或样品稀释时,确保混匀,同时尽量避免起泡。
1.包被抗体:用碳酸盐缓冲液(CBS)或者磷酸盐缓冲液(PBS)根据实验需要,将包被抗体稀释到一定的稀释度,100μl/孔包被, 37℃、2h或者4℃过夜。
2.洗板:弃孔内液体,甩干,10mM PBST(10mM PBS 0.05% Tween-20)洗板2次,每次浸泡1-2min, 350μl/孔,甩干(也可以轻拍将孔内液体拍干)。
3.封闭:含1% BSA或者5%脱脂牛奶的10mM PBST(10mM PBS 0.05% Tween-20)做封闭液,350-400μl/孔,37℃、2h。
4.洗板:同步骤2。(备注:商品化试剂盒一般已经预包被了包被抗体在酶标板上,不需要进行1-4步骤,使用前请注意核实)。
5.加样:分别设零孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl,余孔分别加标准品或待测样品100μl。(注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,一块板要在10 min内上完样品。)酶标板加上盖或覆膜,37℃反应60-120min。为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液。
6.洗板:弃孔内液体,甩干,10mM PBST(10mM PBS 0.05% Tween-20)洗板4次,每次浸泡1-2min,350-400μl/孔,甩干(也可以轻拍将孔内液体拍干)。
7.加检测抗体:根据实验需要,将检测抗体用PBST稀释到一定的稀释度,100μl/孔,37℃、1h。
8.洗板:同步骤6。
9.加二抗:根据实验需要,将二抗用10mM PBST稀释到一定的稀释度,100μl/孔,37℃、1h。
10.洗板:同步骤6。
11.酶标仪读值:以630nm为校正波长,用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值),在加终止液后5min内进行读数。
12.结果判断:
a.每个标准品和样本的OD值须减去零孔的OD值,如设置复孔,则应取其平均值;
b.以标准品的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,使用专业制作曲线软件进行四参数拟合(4-PL),如Origin、ELISACalc等,根据样品的OD值由标准曲线推算出相应的拟合浓度,再乘以稀释倍数即为样本的测定浓度。