1. 细胞样本
悬浮细胞:
4℃,1000-2000×g离心10 min收集细胞,按照106个细胞加入300-500 μL匀浆介质的比例加入匀浆介质,进行机械匀浆,充分破碎(无明显的细胞沉淀,可在显微镜下观察),4℃,10000×g离心10 min,取上清置于冰上待测,若不能当天检测,于-80℃保存,可保存一个月。
贴壁细胞:
吸弃培养液,用PBS(0.01 M,pH 7.4)将细胞洗一遍。用细胞刮刮下细胞(不能用胰酶和EDTA处理),加入2-5 mL PBS(0.01 M,pH 7.4),收集细胞悬液,后处理方法见悬液细胞处理方法。
2. 10%组织匀浆
取0.020-1.0 g新鲜组织块,用2-8℃的PBS(0.01 M,pH 7.4)漂洗,去除血液,滤纸吸干,称重,放入匀浆容器中,按照重量(g):体积(mL)=1:9的比例加入2-8℃的匀浆介质,进行匀浆,4℃,10000×g离心10 min,取上清置于冰上待测,若不能当天检测,于-80℃保存,可保存一个月。
3. 线粒体样本
将10%组织匀浆,4℃,1500×g离心10 min,将上清液4℃,10000×g离心15 min,弃去上清,沉淀即为线粒体。加入匀浆介质溶解后待测。
4. 脂肪组织
取新鲜组织块(20 mg-1.0g),按照重量(g):体积(mL)=1:9的比例加入2-8℃的匀浆介质,进行匀浆,4℃,1500×g离心10 min,用棉签吸取上层乳白色液体,吸取中层澄清液体待测。
5. 微生物样本
将菌液于4℃、1000-2000×g离心10 min收集xi菌,用PBS(0.01 M,pH 7.4)将菌沉淀洗2-3遍,然后按照原菌液体积的1/5-1/10加入裂解液(一般为50 mM Tris-HCl,pH 8.0,2mM EDTA,100 mM NaCl,加溶菌酶至100 ug/ml,0.1% Triton X-100,具体情况根据所测指标选择)重悬菌体,在冰水浴条件下,超声破碎(条件一般是300w,超声10s间隔10s,总时间10分钟,具体条件可根据自身情况而定)。
如何判断是否超声完全:
① 外观判断:超声前菌悬液是浑浊的,超声完全后变的透明、清澈。
② 液体的粘滞性:超声后菌液从枪头滴下不粘连。
③ 高速离心:有用高速离心检测超声破碎程度的(一般用6000×g离心10 min,比一般离心收集菌体的转速高一点)。沉淀是未破碎或破碎不完全的菌体。
一些需要注意的问题:
① 如果超声时出现黑色沉淀,说明超声功率太强。
② 超声时间太长、功率太高对蛋白活性肯定有影响。
③ 尽量防止泡沫的产生。