双抗夹心ELISA操作步骤

ELISA实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）。试剂或样品稀释时，确保混匀，同时尽量避免起泡。

1.包被抗体：用碳酸盐缓冲液（CBS）或者磷酸盐缓冲液（PBS）根据实验需要，将包被抗体稀释到一定的稀释度，100μl/孔包被， 37℃、2h或者4℃过夜。

2.洗板：弃孔内液体，甩干，10mM PBST(10mM PBS 0.05% Tween-20)洗板2次，每次浸泡1-2min， 350μl/孔，甩干（也可以轻拍将孔内液体拍干）。

3.封闭：含1% BSA或者5%脱脂牛奶的10mM PBST(10mM PBS 0.05% Tween-20)做封闭液，350-400μl/孔，37℃、2h。

4.洗板：同步骤2。（备注：商品化试剂盒一般已经预包被了包被抗体在酶标板上，不需要进行1-4步骤，使用前请注意核实）。

5.加样：分别设零孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl。（注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，一块板要在10 min内上完样品。）酶标板加上盖或覆膜，37℃反应60-120min。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

6.洗板：弃孔内液体，甩干，10mM PBST（10mM PBS 0.05% Tween-20）洗板4次，每次浸泡1-2min，350-400μl/孔，甩干（也可以轻拍将孔内液体拍干）。

7.加检测抗体：根据实验需要，将检测抗体用PBST稀释到一定的稀释度，100μl/孔，37℃、1h。

8.洗板：同步骤6。

9.加二抗：根据实验需要，将二抗用10mM PBST稀释到一定的稀释度，100μl/孔，37℃、1h。

10.洗板：同步骤6。

11.酶标仪读值：以630nm为校正波长，用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值），在加终止液后5min内进行读数。

12.结果判断：

a.每个标准品和样本的OD值须减去零孔的OD值，如设置复孔，则应取其平均值；

b.以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，使用专业制作曲线软件进行四参数拟合（4-PL），如Origin、ELISACalc等，根据样品的OD值由标准曲线推算出相应的拟合浓度，再乘以稀释倍数即为样本的测定浓度。