在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加酶结合物和显色剂后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)，有人称之为孵育。
1、温育的时间选择
温育这一步是ELISA测定中容易出现问题的步骤。目前国内ELISA试剂盒的反应温育时间为37℃ 30分钟-1小时，进口ELISA试剂盒则通常为37℃ 1-2小时才能有较完全的结合，低于1小时，可能会影响测定下限。
ELISA属固相免 疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。
温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。
2、温育的温度选择
温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。
在建立ELISA方法作反应动力学研究时，两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2小时，产物的**可达顶峰。为加速反应，可提高反应的温度，有些试验在43℃进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4℃更为彻底，在放射免 疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成的沉淀。但因所需时间太长，在ELISA中一般不予采用。