PCR引物长度把控:
一般引物长度为18~30碱基。总的说来,决定引物退火温度重要的因素就是引物的长度。引物的退火温度一般选择引物的(Tm值-5℃),有的直接用Tm值。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。
在引物长度小于20bp时:[4(G+C)+2(A+T)]-5℃
在引物长度大于20bp时:62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃
另外有许多软件也可以对退火温度进行计算,其计算原理会各有不同,因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化PCR反应,使用确保退火温度不低于54℃的短的引物可获得好的效率和特异性。
总的说来,每增加一个核苷酸,引物特异性提高4倍,这样,大多数应用的短引物长度为18个核苷酸。引物长度的上限并不很重要,主要与反应效率有关。由于熵的原因,引物越长,它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。
在利用软件设计引物的时候,可以通过TM值反过来决定引物的长度,特别是荧光定量PCR的引物,要控制TM=60℃左右。