PCR扩增DNA片段只是一个重要手段。扩增片段的检测和分析才是目的,根据研究对象和目的的不同而采用不同的分析法。琼脂糖凝胶电泳可帮助判断扩增产物的大小,有助于扩增产物的鉴定,点杂交除可鉴定扩增产物外,还有助于产物的分型;Southern杂交分析可从非特异扩增产物中鉴定出特异产物的大小,增加检测的特异性与敏感性,近期发展的一系列产物分析法(PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等)均有助于产物的精 确分析。
一、凝胶电泳分析法
PCR产物可通过琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,以前者常用,通过电泳可以判断扩增产物的大小。在临床检测中,仅通过凝胶电泳判断扩增片段大小即可满足检测的需要。通常制胶方法为100mlTBE加1.5g琼脂糖在微波锅内溶解,稍冷后倒入电泳槽。
电泳后,用溴化乙淀染色20min,然后用去离子水漂洗2次,每次15min,于UV灯下观察结果并拍照。
凝胶电泳不仅可以鉴定产物的大小,检测扩增的情况,还可以用来纯化扩增产物。
二、点杂交
当扩增产物是多条带时,用点杂交更合适。这种方法的基本过程是,首先将扩增的DNA固定到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上,再用放射性或非放射性标记物标记的探针杂交。点杂交还有助于检测突变DNA的突变类型,用于人类遗传病诊断和某些基因的分型。放射性同位素32P标记的寡核苷酸探针检测的敏感性、特异性和方法的可靠性均不容怀疑,对人们认识某些疾 病与基因变异的关系起了很大的作用。但是,由于同位素不稳定和放射性危害,不能常规用于临床或法医检验,用非放射性物质(生物素、荧光素和地高辛等)标记的寡核苷酸探针分析PCR产物以确定核酸序列变异则是一种简便而安 全的方法。非放射性标记物质稳定性高,使用方便、安 全、检测速度快。
三、微孔板夹心杂交法
该法是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特异杂交使产物间接地固定于微孔板上。然后,再用一生物素等非放射性标记物标记���检测探针与产物的另一区域杂交,漂洗后显色即可判断结果,该法需要两个杂交过程来检测一个产物,因此,其特异性较一次杂交的检测法高。该法已用于HBV的检测,其敏感度可达5个HBv DNA分子。此法的敏感性和特异性与PCR 32P探针的Southern杂交法相当。但PCR微孔板夹心杂交法操作简便、快速、避免了同位素标记探针的危害,显色反应类似于临床常规应用的ELISA,适于临床实验室常规应用。
四、PCR-ELISA法
本法避免了电泳和杂交的步骤,适于常规ELISA记数仪检测。因为5'端修饰后仍可进行常规PCR扩增特异靶序列。因此,可以通过修饰一个引物的5′端使其携带便于PCR产物固定的功能基因,而通过另一引物5′-端的修饰使产物便于检测。