PCR反应循环要素讲解

PCR反应循环要素讲解：

1.  预变性（Initial denaturation）

模板DNA*变性与PCR酶的*激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。

2.  循环中的变性步骤

循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列*变性，可能的情况下可 缩短该步骤时间，变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不*，易造成扩增失败。

3.  引物退火（Primer annealing）

退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。

退火温度对PCR的特异性有较大影响。

4.  引物延伸

引物延伸一般在72℃进行（Taq酶合适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略

延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1 min/kbp。

5.  循环数

大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。

6.  zui 后延伸

在后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸*，并使单链产物退火成双链。