PCR反应主要要素引物分析

参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2。

引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：

1、引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。

2、引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

3、引物碱基：G C含量以40-60%为宜，G C太少扩增效果不佳，G C过多易出现非特异条带。ATGC随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

4、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

5、引物3'端的碱基，特别是末及倒数第2个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

6、引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。

7、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。