PCR反应条件的控制

PCR反应条件的控制：

PCR反应的缓冲液 提供合适的酸碱度与某些离子

镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L

底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20～200umol/L

TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）

引物 浓度一般为0.1 ～ 0.5umol/L

反应温度和循环次数

变性温度和时间 95℃，30s

退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃

延伸温度和时间 72℃，1min/kb(10kb内）

Tm值=4(G+C) +2(A+T)

循环次数 ：一般为25 ～ 30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。