试剂显色时 A、B 液按顺序加入且间隔不超过 10min，如先将两液混合再加样则需保证等体积混合。显色剂不宜过多，注意避光反应。显色是zui后一步温育反应，酶将无色底物催化反应呈有色，反应的温度和时间均为影响结果的重要因素，目前市场上大多数进口的 ELISA 检测显色温度处于 18~30℃。一定时间内，阴性孔可保持无色，但阳性孔会随时间的延长而显色加强。研究表明，显色温度对实验结果有明显影响，显色温度不同，试剂zui 低检测能力差距非常大，温度低于 21℃时试剂盒对于质控物的检出能力下降，温度过低导致结合反应速率变慢，显色不充分，造成低值阳性结果的漏检，所以操作中应严格控制温度。显色时间不宜过短，因为一些低滴度可能不能及时出现反应，造成假阴性结果。结果判断应按照说明书在规定时间内完成，研究报道终止反应后的时间对 OD 值结果有明显影响，10~15min阳性结果 OD 值逐渐下降，阴性结果的 OD 值有所上升，所以必须严格按照操作说明进行，薛春杨等认为结果判断需在加入终止液后 10min 内完成，避免出现孔内结晶影响酶标仪的测试，避免强光下进行。
在加液和混合过程中产生气泡、微孔条底部不透明、带水滴、有划痕及不规则的表面都可能引起吸光值的升高，易造成假阳性结果，若显色但酶标仪读值为阴性的灰色值样区的样本不管其是否来源于高危人群均需复检并参考参比试剂。