变性琼脂糖凝胶电泳测定:
1、制胶
1g琼脂糖溶于72ml水中,冷却至60℃,10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% *(12.3 M)。10×MOPS电泳缓冲液
浓度 成分
0.4M MOPS,pH 7.0
0.1M 乙酸钠
01M EDTA
灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25 ?l溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
2、准备RNA样品
取3?gRNA,加3倍体积的甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10?g/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
3、电泳
上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品加入上样孔。5-6V/cm电压下2h,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。
4、紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型),上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体RNA带的上面出现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带,RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。