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PCR引物设计原则陈述

一、引物设计有3 条基本原则：
首先引物与模板的序列要紧密互补；
其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；
再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

二、引物设计原则：
1、引物长度：18-26bp，可放宽至18-30bp（有研究表明超过30bp再增加引物长度意义不大）；
2、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC 随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列存在；
3、引物Tm：54-58℃，可放宽至52～62℃，GC%>60%可进一步放宽；
4、扩增子Tm：>92℃；
5、3'端：优选三联体WSS、SWS、TTS，二连体GC，单体S，尽量规避WWW、CGW、GGG、CG；
6、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增；
7、末端2bp 为GC；
8、引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等；
9、其他：避免3'端8bp及以上序列与模板多位点互补，尽量避免上下游3'端4bp及以上反向互补，尽量避免内部回文。

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