胚心肌组织来源细胞

细胞传代步骤： 
如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。3. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。4. 将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

我司全程提供细胞生物体、生长特性、来源、器官、类型、形态、培养条件、应用、组织、冻存条件等复苏及冻存细胞株说明书信息，我们专业您的细胞系实验，让您实验再无烦扰！

英文简称：CCCS-HHM-2细胞

产品名称：胚心肌组织来源细胞

货号：BJ-01X9964

规格：心肌

形态特性:DMEM

生长特性:贴壁

实验要点及说明 :

1．本方法适用于贴壁细胞培养，而不适用于悬浮细胞培养，悬浮细胞可使用滴片法； 

2．所使用的盖玻片应该为玻璃**，并经过铬酸洗液处理； 

3．盖玻片非常薄，易碎，取放盖玻片时动作要轻； 

4．如果需要更多生长状态一致的细胞，可以使用较大的培养皿，但不宜过大，以避免培养液的浪费和增加污染机率； 

5．如果细胞贴壁生长能力较差，可将盖玻片在0.5%多聚赖氨酸溶液中浸泡5-10分钟并自然晾干。

培养操作:

1）复苏细胞：将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加 入 4mL 培养基混合均 匀。在 1000RPM 条件下离心 4 分钟，弃去上清液，补 加 1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培 养过夜（或将 细胞悬液加入 10cm 皿中，加入约 8ml 培养基，培养过夜）。天换液并 检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。      

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于 37℃培 养箱中消化 1-2 分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分 变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养 瓶后加少量培养基终止消 化。  

3. 按 6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在 1000RPM 条件下离心 4 分 钟，弃去上清液，补加 1-2mL 培养液后吹匀。

4. 将细胞悬液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为类；

1. 细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶，细胞变圆 脱 落后，加入 1ml 含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2. 4 min 1000rpm 离心去掉上清。加 1ml 血清重悬细胞，根据细胞数量加 入血 清和 DMSO，轻轻混匀，DMSO 终浓度为 10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存 1ml 细胞悬液，注意冻 存管做好标识。

3. 将冻存管置于程序降温盒中，放入-80 度冰箱，2 个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

使用方法：

收到细胞后，请按照以下方法进行操���。

1. 取出25cm2培养瓶，75%酒精，拆下封口膜，放入37℃，5% CO2细胞培养箱中静置6-8小时或者过夜，以稳定细胞状态。

2. 待细胞达到80%汇合时准备进行传代培养。

3. 细胞传代

1) 吸出25cm2培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液约1mL至培养瓶中，37℃温浴3min左右；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后吸弃消化液，再加入完全培养液终止消化；

3) 用吸管轻轻吹打混匀，按1:2或1:3等适当的比例进行接种传代，然后补充新鲜的完全培养基至5mL，放入37℃，5% CO2细胞培养箱中培养；

4) 待细胞完全贴壁后，培养观察。之后每隔2-3天更换新鲜的完全培养基。

实验报告：

一、分离与培养：

1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，后将组织剪成1mm3左右大小；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；

二、荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min，后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

Aggrecanase-2/ADAMTS-5  软骨蛋白聚糖抗体规格: 0.1ml

CAGE1/CT3/CT95  肿瘤/睾丸抗原3抗体规格: 0.2ml

CD66d/CEAM3  癌胚抗原相关  粘附分子3抗体规格: 0.2ml

CLUAP1  成簇相关蛋白1抗体规格: 0.1ml

CTAG1B/Cancer/testis antigen 1B  肿瘤/睾丸抗原1B规格: 0.2ml

CTAG2  肿瘤/睾丸抗原2抗体规格: 0.2ml

CTAGE5  皮肤T  瘤相关抗原5抗体（脑膜瘤表达抗原6）规格: 0.2ml

AGPAT1  溶血磷脂酰基转移酶抗体规格: 0.2ml

EBAG9/RCAS1  肿瘤相关表面抗原RCAS1抗体规格: 0.2ml

FAM120C  构成激活过氧化酶活化增生受体γ样蛋白2抗体规格: 0.2ml

MUM1/FLJ14868  突变的黑色素瘤相关抗原1抗体规格: 0.2ml

FMNL1  成蛋白相关蛋白1抗体规格: 0.2ml

GAGE7/Cancer/testis antigen family 4 member 7  肿瘤/睾丸抗原家族4亚型7抗体规格: 0.2ml

胚心肌组织来源细胞50mL Denhardt’s Solution,100X  Denhardt’s Solution,100X  常温保存　　IL-15 / IL15 / Interleukin 15 抗體, 兔單抗 ELISA    50 µg

25mL Denhardt’s Solution,50X Denhardt’s Solution,50X 常温保存　　ICAM-1 / CD54 抗體, 鼠單抗 WB    50 µg

250mL Dextrose Gelatin Veronal DGV  Dextrose Gelatin Veronal DGV  常温保存　　E-Selectin / CD62e / SELE 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 ELISA    50 µg

250mL Dialysis Tubing Wash Buffer（透析袋洗涤液），5X Dialysis Tubing Wash Buffer，5X 常温保存　　IFNGR1 / CD119 抗體, 鼠單抗 FCM    50 µg

250mL Diluting Solution，2X  Diluting Solution，2X  常温保存　　IFNA4 抗體, 兔多抗 ELISA    400 µg

100mL DIPSO Buffer,0.2M,pH7.0  DIPSO Buffer,0.2M,pH7.0  常温保存　　IFNA4 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 ELISA    50 µg

100mL DIPSO Buffer,0.2M,pH7.4  DIPSO Buffer,0.2M,pH7.4  常温保存　　IFNGR1 / CD119 抗體 (PE), 鼠單抗 FCM    25 Test

100mL DIPSO Buffer,0.2M,pH8.0  DIPSO Buffer,0.2M,pH8.0  常温保存　　IFNGR1 / CD119 抗體 (APC), 鼠單抗 FCM    25 Test

100mL DIPSO Buffer,0.2M,pH8.5  DIPSO Buffer,0.2M,pH8.5  常温保存　　IFNGR1 / CD119 抗體, 鼠單抗 ELISA    50 µg

100mL Dulbecco's Phosphate Buffered Saline，Ca-Mg  (杜氏磷酸盐缓冲盐水，无钙镁） Dulbecco's Phosphate Buffered Saline，Ca-Mg free  常温保存　　IFNGR1 / CD119 / IFN-gamma-R1 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 ELISA    50 µg

250ml E. Coli Lysis Buffer  E. Coli Lysis Buffer  常温保存　　IFNGR1 / CD119 / IFN-gamma-R1 抗體, 兔單抗 ELISA   WB    50 µg

250mL E. Coli Lysis Buffer-II,pH7.4  E. Coli Lysis Buffer-II,pH7.4  常温保存　　E-Selectin / CD62e / SELE 抗體 (PE), 兔單抗 FCM    25 Test

25mL E.coli Sample Buffer  E.coli Sample Buffer  常温保存　　E-Selectin / CD62e / SELE 抗體, 兔單抗 IF   ICC/IF    50 µg

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