ELISA 实验中各类组织匀浆(不易匀浆的组织)的采集、处理和保存;(需要测蛋白浓度)
1、采集组织,在冰冷的生理盐水中漂洗,除去血液,滤纸拭干,称重,剔除附属的结缔组织,称取组织块。
2、用移液管量取 0.1M PBS 或者用 0.86%冷生理盐水,匀浆介质或生理盐水的体积总量应该是组织块重量的 9 倍,用眼科小剪尽快剪碎组织块(天然时操作要在冰水浴中进行,将盛有组织 的小烧杯放入冰水中)。
3、匀浆的方式有多种:
a)手工匀浆:将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中,再将剩余的 1/3 匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块,一起倒入匀浆管中进行匀浆,左手持匀浆管将下 端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手将捣杆垂直插入套管中,上下转动研磨数十次(6~8 分钟),充分研碎,使组织匀浆化。
b)机器匀浆:用组织捣碎机 10000~15000r/min 上下研磨制成 10%组织匀浆,也可用内切式组织匀浆机制备(匀浆时间 10 秒/次,间隙 30 秒,连续 3~5 次,在冰水中进行),皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。
c) 超声粉碎:用超声粉碎机进行粉碎,可用 Soniprep150 型超声波发生器以振幅 14 微米超声处理 30 秒使细胞破碎,也可用国产超声波发生仪,用 40 安培,5 秒/次,间隙 10 秒反复 3~5 次。
4、将制备好的 10%匀浆用离心机 4℃,3000rpm 离心 15min,将离心好的匀浆留上清,弃下面沉淀。
5、取上清。 分装冻存备用,
2-8℃下,可放置保存 24-48 小时;
-20℃下,可放置保存 1 个月;
-70℃下,可放置保存 6 个月;
6、根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种 ELISA 测定。