荧光定量PCR（Real-time PCR），是指在PCR扩增反应体系中加入荧光基团，通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测,后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。反应中对照的目的是对检测的各个环节进行监控，因此我们按照检测的流程对对照进行梳理。没有一种对照是wan美的，在检测中我们要根据自己的需求来进行灵活选择和搭配。建议每一次检测时添加一个能对从提取到扩增环节进行监控的质控品或标准物质；每份检测样品中添加内标（如果样品种类比较多样建议使用人工内标，如果样品类型为相对固定的动物组织建议使用内参基因）；扩增阳性对照，扩增阴性对照，无模板对照和ROX对照。有条件的添加临床阳性对照和临床阴性对照，在怀疑提取环节或者反转录环节出现问题时使用核酸提取对照和反转录对照。不定期使用仪器空白对照。
一、阳性对照与污染
不可否认的一个事实是阳性对照可以增加实验室污染的风险。这种污染的来源一种是直接来源于扩增阳性对照的污染。对于扩增阳性对照来说通常10000拷贝/微升（CT值约25）是比较理想的，但是有一些试剂盒厂家的扩增阳性对照设置在CT值20以下，比大部分阳性样本都强。这么高浓度的对照给实验室带来了巨大的污染风险，原因可能仅仅是因为试剂厂家担心其阳性对照不稳定，长时间存放阳性对照降解。另一种污染来自于扩增产物的处理不当，或者实验室的设计布局不合理。
二、初筛和确诊
对照与实验目的的关系好像从来没有人提及过。根据笔者多年在检测实验室的经验，分享一点个人的心得，欢迎大家批评指正。
对于初筛实验，我们希望提高真阳性检出率，即提高诊断敏感性。我们需要检测系统达到高检测效率，因此要在不同环节添加阳性对照，确保每个环节的检测效率高。
对于确诊实验，我们希望提高真阴性检出率，即提高诊断特异性。我们需要确保检测系统不出现假阳性，因此要在不同环节添加阴性对照，减少非必须的阳性对照，甚至要在样品盘的不同位置中随机插入几个阴性对照，确保实验过程中没有被污染。