温度的选择取决于Taq DNA聚合酶的zui 适温度。一般取70～75℃，在72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达35～100个核苷酸/秒。每分钟可延伸1kb的长度，其速度取决于缓冲溶液的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质。扩增片段如短于150bp，则可省略延伸这一步，而成为双温循环，因Taq DNA聚合酶在退火温度下足以完成短序列的合成。对于100～300bp之间的短序列片段，采用快速、简便的双温循环是行之有效的。