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PCR反应Taq DNA聚合酶

     PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶链式反应,可以选择性扩增一段DNA序列。一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130 min,95℃ 40 min, 97℃ 5 min。现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶,这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。

Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下,30 min,掺入10 nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率,一般PCR中出错率为2×10-4 核苷酸/每轮循环,在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意.在100 μl PCR反应中,1.5-2单位的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环。

所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减.酶量过多会使产物非特异性增加,过少则使产量降低。

反应结束后,如果需要利用这些产物进行下一步实验,需要预先灭活Taq DNA聚合酶, 灭活Taq DNA聚合酶的方法有:

(1)PCR产物经酚: 抽提,乙醇沉淀。

(2)加入10 mmol/L的EDTA螯合Mg 2+ 。

(3) 99-100℃加热10 min。目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。