免yi 组化(IHC)试验技巧:
1. 把要做的切片先分好,做几个抗体可分几盒,不正常组织与正常组织要分开。其余做预实验用。
2. 选择实验要做的抗体时,要结合他们的正常组织和癌组织的分别表达率。
3. 试剂盒的选择可结合生物su强弱的情况。如:肝组织生物su含量高,S-P试剂盒生物su含量也高,故不能配合使用。
4. 每次开始做时,都必须先清点实验的必需品是否齐全。想好可能发生的意外,并先想好补救措施。当抗体不够用的情况下,原先买的抗体不要用完,留做可能需要的验证试验。新的抗体要尽量同公司,同批号。
5. 烤片(单一或综合)程度要适情况而定,可中途拿出甩一甩,尽可能先放在烤箱里烤3小时以上。切勿把片烤得太久了。程度刚好,脱蜡效果才会好。注意做好不同条件的切片标记。注意温度稳定,再烤片。
6. 二甲苯脱蜡。温度过低时,可先把二甲苯整罐放进烤箱加热,或者可把片放在二甲苯里一起加热脱蜡,这样效果会更好;若温度适宜,那还是在室温下脱蜡,要不可能会适得其反。时间也是适情况而定。
7. 高压修复时,要注意稀释比例,修复液的种类(EDTA不可以重新进行利用,可能发生交叉作用),PH值等。高压锅内压力未降至正常时不可打开,压力正常后可多放会儿,能更好的利用余压,把握程度。若是多次修复,每次都需先把锅内热水倒掉,换冷水,保证条件的可重复性。
8. 抗体反复冻融可使效价降低。抗体要防止污染。不可用塑料保存,塑料可吸附抗体。抗体稀释:应遵循“现用现配"的原则,对于PBS(其他稀释液,注意PH值,PBS为偏中碱性)稀释的抗体要当天使用。稀释比例恰好为佳,注意前带和后带效应。
9. 吹干封片时不能有泡泡。若是没封好,可进行二甲苯、酒精脱树胶,吹干再次封片,但镜下效果会明显变差。因而,若没必要,不要再次脱胶。DAB显色需用中性树胶封片,AEC(易溶于有机溶剂)需用水性胶封片。
10. 刚封完的载玻片会移动,故切片还没干时,尽量不要碰到盖玻片,可避免树胶溢出,片的整体效果不好。