血吸虫PCR检测试剂盒参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。
引物: 引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则:
1、引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。
2、引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
3、引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
4、避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3’端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
5、引物3’端的碱基,特别是zui末及倒数第2 个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
6、引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列zui有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。
7、引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。