在PCR自动热循环中，关键的因素是变性与退火的温度。如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30个循环，扩增片段500bp。在这里，每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要30～60s，这一迟滞时间的长短取决于几个因素，包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源(水浴或加热块)以及两步骤间的温度差，在设置热循环时应充分给以重视和考虑，对每一仪器 均应进行实测。关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物 之间的距离;距离越远，合成靶序列全长所需的时间也越长，前文给出的反应时间是按适于合成长度500bp的靶序列拟定的。下面就各种温度的选择介绍：
1、模板变性温度 变性温度是决定PCR反应中双链DNA 解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。一般取90～95℃。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种，时间过久没有必要;反之，在高温时间应尽量缩短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后高变性温度不宜超过95℃。
2、引物退火温度 退火温度决定PCR特异性与产量;温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降;温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般先由37℃反应条件开始，设置一系列对照反应，以确定某一特定反应的合适退火温度。也可根据引物的(G+C)%含量进行推测，把握试验的起始点，一般试验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度TTm(melting temperature)低5℃，可按公式进行计算：
Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃
其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。例如，20个碱基的引物，如果(G+C)%含量为50%时，则Ta的起点可设在55℃。在典型的引物浓度时(如0.2μmol/L),退火反应数秒即可完成，长时间退火没有必要。