PCR反应五要素:
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物: 引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
产品参数:
产品名称: 猪种特异性基因检测试剂盒(荧光PCR法)
规格: 50T
货号:BH-P64088
公司产品仅用于科研分类:荧光定量PCR试剂盒
储存条件:-20℃避光保存,避免反复冻融。
运输:低温、避光,快递免费送货上门。
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使用及效果:
标准的PCR反应体系:
10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10~100pmol
模板DNA 0.1~2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加双或三蒸水至 100ul
PCR反应特点
(1) 特异性强
PCR反应的特异性决定因素为:
①引物与模板DNA特异正确的结合;
②碱基配对原则;
③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性;
④靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高。
(2) 灵敏度高
PCR产物的**量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在学中zui小检出率为3个。
(3) 简便、快速
PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2~4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广。
(4) 对标本的纯度要求低
不需要分离病毒或及培养细胞,DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活PCR技术概论。
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设计引物应遵循以下原则:
①引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。
②引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3’端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基,特别是zui末及倒数个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列zui有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
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大豆慢生根瘤菌神经诱导胚胎发育相关蛋白Churchill抗体Human F13(Coagulation Factor XIII) ELISA Kit人内脏脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂(vaspin)试剂盒
粘质沙雷氏菌二氢嘧啶酶相关蛋白3抗体Human Grb10(Growth Factor Receptor Bound Protein 10) ELISA Kit人内源性糖皮质(GC)试剂盒
藤黄微球菌转录激活蛋白CRSP9抗体Human F5(Coagulation Factor V/Plasma Factor V) ELISA Kit人内源性分泌型糖基化终产物受体(esRAGE)试剂盒
毛栓孔菌神经网蛋白CopineVI抗体Human Grb2(Growth Factor Receptor Bound Protein 2) ELISA Kit人内皮脂肪酶(EL)试剂盒
糙孢篮状菌脑型肉碱棕榈酰转移酶1C抗体Human F13B(Coagulation Factor XIII B Polypeptide) ELISA Kit人内皮抑素(ES)试剂盒
大球盖菇补体因子B抗体Human EPHA1(Ephrin Type A Receptor 1) ELISA Kit人内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)试剂盒
韩国鞘氨单胞菌乙酰胆碱受体前体蛋白AChRα1抗体Human F7(Coagulation Factor VII) ELISA Kit人内皮特异分子-1(ESM-1)试剂盒
*正红菇猪瘟病包膜糖蛋白E2抗体Human ERK(ELK-Related Tyrosine Kinase) ELISA Kit人内皮素2(EDN2)试剂盒
酿酒酵母冷休克结构域蛋白C2抗体Human EPHA10(Ephrin Type A Receptor 10) ELISA Kit人内皮素1受体(EDNRA)试剂盒
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榛针孢酵母致癌基因C-Myc抗体Human EphA2(Tyrosine protein kinase receptor A2) ELISA Kit人母亲DPP同源物4(Smad 4)试剂盒
肠膜明串珠菌肠膜亚种胆囊收缩素8抗体Human ERK(ELK-Related Tyrosine Kinase) ELISA Kit人末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)试剂盒
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鸟苷酸环化酶激活蛋白3抗体JNK2/FITC 荧光素标记氨末端激酶2抗体IgG