首页 >>> 公司新闻 >

公司新闻

冰冻片常采用液氮法制备做法

冰冻片常采用液氮法制备,具体做法如下:


1.包埋 切片


将组织置于20%-30%蔗糖溶液1~3天沉底,利用高渗吸收组织中水分,减少组织含水量。取出组织,预冷PBS清洗后平放于软塑瓶盖或特制小盒内(比如用铝箔纸折成有口的方盒),加入适量OCT包埋剂浸没组织,然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内,当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾,此时小盒保持原位切勿浸入液氮中,大约10-20s组织即迅速冰结成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱贮存备用,或置入恒冷箱切片机冰冻切片。





2.固定


在冰冻切片机上切片,完成后用预冷的4%多聚甲醛室温固定20-30min,冷水清洗3-5次,-20度保存。


3.冰冻切片机切片,厚度3-5微米


4.切片后固定


将切好的冰冻片用预冷的组织固定液固定30min,蒸馏水洗3-5次,洗干净固定液,自然晾干后进行下一步实验或-20℃保存


冰冻片免yi 荧光实验步骤


热修复抗原:将切片浸入修复缓冲液(柠檬酸盐或EDTA修复液),电炉或微波炉加热至沸腾后断电,间隔5-10 min后,反复1-2 次。室温自然冷却后水洗一次


滴加封闭液(5%BSA或二抗同源血清), 37℃孵育30 分钟。甩去多余液体, 不洗。


滴加适当稀释的一抗,4℃过夜后37℃复温30min,也可37 ℃ 孵育2 h。PBS洗5min×3 次。


滴加生物素化山羊抗小鼠IgG(或兔IgG),37℃ 30 min。PBS洗5min×3 次。


滴加试剂SABC-FITC,37℃ 孵育30 min。PBS洗5 min×4 次。


DAPI复染2-3min,充分水洗,封片观察。