设定Tm有几种公式。高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。根据GC含量估算Tm。确定引物Tm zui可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列1级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得zui佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比zui低的Tm低5℃。或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。