定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法

    原始样品可为细胞、组织、培养上清、免yi 沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。

1．培养细胞或药wu 处理。

2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。

3．加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 μl /w或 75 cm² plate, 500-1000 μl/瓶)，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。

4．超声 10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。

5．煮沸样品5 minutes。

6．离心 12000g, 5 min，取上清。

7．电泳分离：上样15μl~20 μl 至 SDS-PAGE 胶 ( 10 cm x 10 cm)电泳。
如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1 ml per 10⁷ cells/ 100 mm dish/ 150 cm² flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min， 14000g离心15min（ 4℃），弃沉淀，用Bradford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。

注意：一般上样20~30 μg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100μg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。