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免 疫荧光(IF)操作步骤

 免 疫荧光(immunofluorescence，IF)，通常是指用荧光标记的抗体示踪或检查样品中相应抗原的方法。操作步骤：

1、细胞准备：对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
2、固定：根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min.
3、通透：使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min.
4、封闭：使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min.
5、一抗结合：室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min.
6、二抗结合：间接免 疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。
7、封片及检测：滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。

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