大鼠骨骼肌微血管内皮细胞

实验方法:

一、悬浮细胞的分离方法
组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，可采用低速离心。经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。
二、实体组织材料的分离方法
对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。其中，机械分散法的特点是简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差，适用于处理纤维成分少的软组织。消化分离法是指把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。

细胞简介：

大鼠骨骼肌微血管内皮细胞分离自四肢肌肉组织；骨骼肌又称横纹肌，肌肉中的一种，约占全身重量的40%。骨骼肌纤维为长柱形的多核细胞，肌膜的外面有基膜紧密贴附。属于横纹肌，横纹肌还包括心肌与内脏横纹肌，其中骨骼肌主要分布于四肢。每块肌肉都是具有一定形态、结构和功能的器官，有丰富的血管、分布，在躯体神经支配下收缩或舒张，进行随意运动。微血管又称。分布于各种组织和细胞间的微细的血管。介于微动脉和微静脉之间。平均直径7-9微米，数量极多，成网状分布。管壁由一层内皮细胞及一薄层基膜组成，厚约0.5微米。基膜外面有薄层结缔组织，其中有纤维细胞、巨噬细胞和周细胞等。细的微血管由一个内皮细胞围成管腔，较粗的微血管由2-3个内皮细胞围成。分布于肌肉组织、神经组织和结缔组织中的微血管，内皮细胞间为缝隙连接（缝隙宽150埃），称连续微血管。血管内皮细胞在器官和组织的结构和功能上起着非常重要的作用。并与多种的发生与发展有关。近年来血管内皮细胞在炎症、休克等一系列病理生理改变中的重要性愈来愈受到人们的重视。研究发现，不同来源的内皮细胞在生物学特征、结构和功能等方面均存在一定差别，而同是微血管内皮细胞，它们又存在器官和组织的特异性。骨骼肌组织是动物体内含量多的组织，肌肉组织供血丰富，是研究内皮细胞功能和血管**的理想靶组织。

培养信息：

包被条件：PLL（0.1mg/ml），明胶（0.1%）

培养基：含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率：每2-3天换液一次

生长特性：贴壁

细胞形态：内皮细胞样

传代特性：可传2-3代

消化液：0.25%胰蛋白酶

培养条件：气相：空气，95%；CO2，5%

大鼠骨骼肌微血管内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的佳培养状态。

方法简介：

实验室分离的大鼠骨骼肌微血管内皮细胞采用胶原酶消化结合差速贴壁法、培养基筛选制备而来，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶。

质量检测：

实验室分离的大鼠骨骼肌微血管内皮细胞经CD31荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、、酵母和等。

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实验具体步骤：

（1）动物福利：小鼠麻醉牺牲/处死，或者断颈处死；

（2）小鼠：可以将小鼠腹部使用75%乙醇擦拭3次，或者简单粗暴的使用75%乙醇在烧杯中浸泡3min，然后转移至无菌操作台使用无菌吸水纸/棉花将酒精擦拭干净；
（3）取出心脏组织：用眼科剪在镊子的配合下打开腹腔，取出心脏组织，置于含有2X双抗冰冷PBS的培养皿中；
（4）组织：在含有2X双抗PBS中将心脏一分为二，充分洗涤里边的血液，/3次，每次5min；
（5）破碎组织：使用眼科钳或者剪刀，将心脏组织剪碎至1-3 mm3大小组织块；（备注：如果可以使用0.08% 胰蛋白酶和0.3 mg/ml胶原酶Ⅰ于37℃联合消化组织3-5 min，

利于后期细胞从组织块中爬出来，同时能够消除部分结缔组织等）

镊子将组织块种植于培养皿中（备注：破碎组织块可能还含有液体，可以在一个无菌培养皿底沾几下，把液体）；种植完成后，可以将培养皿正置3-5小时，然后更换培养皿的
盖子正置放置过夜（也可以使用封口膜密闭培养皿在4℃正置过夜）；

（7）培养基培养：将组织块中轻柔缓慢的加入完全培养基，然后在恒温潮湿细胞培养箱（37℃，5% CO2）培养48h后观察单个细胞从组织块中爬出情况，一般3-5 day能够达到传代的爬出效率；

根据细胞数量种植到对应的培养皿/瓶中；

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