大鼠食管上皮细胞

实验方法:

一、悬浮细胞的分离方法
组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，可采用低速离心。经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。
二、实体组织材料的分离方法
对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。其中，机械分散法的特点是简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差，适用于处理纤维成分少的软组织。消化分离法是指把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。

细胞简介：

大鼠食管上皮细胞分离自食管组织；食管是咽和胃之间的消化管，食管在系统发生上起初很短，随着颈部的伸长和心肺的下降，而逐渐增长。食管可分为颈段、胸段和腹段。脊椎动物食管的颈段位于气管背后和脊柱前端，胸段位于左、右肺之间的纵膈内，胸段通过膈孔与腹腔内腹相连，腹段很短与胃相连。在发育过程中，食管的上皮细胞增殖，由单层变为复层，食管使管腔变狭窄，甚至一度闭锁，以后管腔又重新出现。哺乳动物的食管结构上由内向外分四层：黏膜层、黏膜下层、肌层和外膜。其中，黏膜层，包括上皮、固有层和黏膜肌层。上皮为较厚的未角化的复层扁平上皮，耐摩擦，有保护作用。在食管与胃贲门交界处，复层扁平上皮突然变成单层柱状上皮。食管被一层线性排列的、无角化、潮湿的复层扁平上皮细胞覆盖，其顶端细胞膜和细胞间连接复合体联合在一起产生有效渗透屏障，防止食管内容物的渗入。特别的是，层屏障使表层细胞的基质外侧细胞膜和深层细胞的全部细胞膜不暴露于食管腔内规律的大幅波动的渗透压之下。从组织学上讲，食管上皮由两层组成，基底层和分化层；其中，仅基底层的细胞可以增殖，然后向食管腔移行。移行过程伴随有分化的发生和分化标记的依序表达。食管上皮细胞的培养是研究食管正常生理机制和食管癌变机制的非常好的体外模型。

培养信息：

包被条件 鼠尾胶原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培养基 含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 上皮细胞样

传代特性 可传1-2代

消化液 0.25%胰蛋白酶

培养条件 气相：空气，95%；CO2，5%

方法简介：

公司实验室分离的大鼠食管上皮细胞采用-胶原酶联合消化法，并通过上皮细胞培养基培养筛选制备而来，细胞总量约为5×10?cells/瓶。

质量检测：

公司实验室分离的大鼠食管上皮细胞经PCK荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、、酵母和等。

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实验具体步骤：

（1）动物福利：小鼠麻醉牺牲/处死，或者断颈处死；

（2）小鼠：可以将小鼠腹部使用75%乙醇擦拭3次，或者简单粗暴的使用75%乙醇在烧杯中浸泡3min，然后转移至无菌操作台使用无菌吸水纸/棉花将酒精擦拭干净；
（3）取出心脏组织：用眼科剪在镊子的配合下打开腹腔，取出心脏组织，置于含有2X双抗冰冷PBS的培养皿中；
（4）组织：在含有2X双抗PBS中将心脏一分为二，充分洗涤里边的血液，/3次，每次5min；
（5）破碎组织：使用眼科钳或者剪刀，将心脏组织剪碎至1-3 mm3大小组织块；（备注：如果可以使用0.08% 胰蛋白酶和0.3 mg/ml胶原酶Ⅰ于37℃联合消化组织3-5 min，

利于后期细胞从组织块中爬出来，同时能够消除部分结缔组织等）

镊子将组织块种植于培养皿中（备注：破碎组织块可能还含有液体，可以在一个无菌培养皿底沾几下，把液体）；种植完成后，可以将培养皿正置3-5小时，然后更换培养皿的
盖子正置放置过夜（也可以使用封口膜密闭培养皿在4℃正置过夜）；

（7）培养基培养：将组织块中轻柔缓慢的加入完全培养基，然后在恒温潮湿细胞培养箱（37℃，5% CO2）培养48h后观察单个细胞从组织块中爬出情况，一般3-5 day能够达到传代的爬出效率；

根据细胞数量种植到对应的培养皿/瓶中；

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