人真皮微血管内皮细胞

细胞简介：

人真皮微血管内皮细胞分离自真皮组织；真皮，位于表皮深层，向下与皮下组织相连，真皮结缔组织的胶原纤维和弹性纤维互相交织在一起，埋于基质内。其内分布着各种结缔组织细胞和大量的胶原纤维弹性纤维，使皮肤既有弹性，又有韧性。其由两层组成——层与网状层。真皮的结构组成是胶原蛋白、弹性纤维以及基质。微血管内皮细胞（MEC）在炎症反应、肿瘤生长、创面过程中起着非常重要的作用。在创面研究领域，由于表皮细胞、真皮成纤维细胞体外培养技术的成熟，人们对这两种细胞早已进行了大量深入的研究。与之相比，对参与创面过程的另一种主要细胞——真皮微血管内皮细胞，则因其体外分离培养技术的困难而使相关的研究受限。

培养信息：

包被条件 PLL（0.1mg/ml），明胶（0.1%）

培养基 含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 内皮细胞样

传代特性 可传2-3代

消化液 0.25%胰蛋白酶

培养条件 气相：空气，95%；CO2，5%

方法简介：

公司实验室分离的人真皮微血管内皮细胞采用胶原酶-中性蛋白酶混合消化法结合密度梯度离心法、后通过内皮细胞培养基培养筛选制备而来，细胞总量约为5×10?cells/瓶。

质量检测：

公司实验室分离的人真皮微血管内皮细胞经CD31荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、、酵母和等。

实验具体步骤：

（1）动物福利：小鼠麻醉牺牲/处死，或者断颈处死；
（2）小鼠：可以将小鼠腹部使用75%乙醇擦拭3次，或者简单粗暴的使用75%乙醇在烧杯中浸泡3min，然后转移至无菌操作台使用无菌吸水纸/棉花将酒精擦拭干净；
（3）取出心脏组织：用眼科剪在镊子的配合下打开腹腔，取出心脏组织，置于含有2X双抗冰冷PBS的培养皿中；
（4）组织：在含有2X双抗PBS中将心脏一分为二，充分洗涤里边的血液，/3次，每次5min；
（5）破碎组织：使用眼科钳或者剪刀，将心脏组织剪碎至1-3 mm3大小组织块；（备注：如果可以使用0.08% 胰蛋白酶和0.3 mg/ml胶原酶Ⅰ于37℃联合消化组织3-5 min，

利于后期细胞从组织块中爬出来，同时能够消除部分结缔组织等）

镊子将组织块种植于培养皿中（备注：破碎组织块可能还含有液体，可以在一个无菌培养皿底沾几下，把液体）；种植完成后，可以将培养皿正置3-5小时，然后更换培养皿的
盖子正置放置过夜（也可以使用封口膜密闭培养皿在4℃正置过夜）；

（7）培养基培养：将组织块中轻柔缓慢的加入完全培养基，然后在恒温潮湿细胞培养箱（37℃，5% CO2）培养48h后观察单个细胞从组织块中爬出情况，一般3-5 day能够达到传代的爬出效率；

根据细胞数量种植到对应的培养皿/瓶中；

实验方法:

一、悬浮细胞的分离方法
组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，可采用低速离心。经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。
二、实体组织材料的分离方法
对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。其中，机械分散法的特点是简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差，适用于处理纤维成分少的软组织。消化分离法是指把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。

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