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PCR引物要素基本要求

PCR引物要素基本要求:
1、引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。
2、引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
3、引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
4、避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
5、引物3'端的碱基,特别是末及倒数第2个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
6、引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列有适宜的酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
7、引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量:每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。