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PCR聚合酶链式反应步骤

PCR聚合酶链式反应原理:DNA双链复制,DNA双链结构高温氢键断裂。

目的是在生物体外大量扩增特定DNA片段的分子生物学技术,其特点是可以以微量的DNA为模板,快速扩增得到大量拷贝。

反应步骤:

1、变性:利用高温(93-98℃)使双链DNA解螺旋,高温使两条DNA链间的氢键断裂。在第1个循环之前,通常加热时间较长以确保模板DNA完全分离,仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟,接下来机器就控制温度进入循环阶段。

2、退火:将反应温度降低至50-65℃(通常比引物 值低3-5℃)持续20-40s,从而使引物结合于单链DNA上。若退火温度过低,容易造成非特异扩增,而退火温度过高,引物可能根本不结合。

3、延伸:此步骤的温度取决于所用的DNA聚合酶。 Taq(Thermus aquaticus)聚合酶的热稳定DNA聚合酶的zui 佳活性温度约为75–80°C,但通常使用的延伸温度为72°C。 在这一步骤中,DNA聚合酶通过从反应体系中添加的5'至3'方向的游离dNTP,从而合成与DNA模板链互补的新DNA链。延伸所需的精 确时间取决于所用的DNA聚合酶和待扩增的DNA片段的长度。 传统的Taq 酶估计合成1000bp大概需要1分钟、较新的Tbr 酶(来自于嗜热菌Thermus brockianus)约40s、商业公司**的融合型聚合酶仅需约10-15s。有修正功能的则会比较慢。

上述循环结束后,将进入终延伸阶段:此步骤是可选的,但要在70-74°C)(PCR中使用的大多数聚合酶zui 佳活性所需的温度范围)下进行5-15分钟。 zui 后一个PCR循环,以确保所有剩余的单链DNA的冈崎片段被补齐。

zui 终保持:zui 后一步将PCR仪反应室无限期地冷却至4–15°C,可用于PCR产物的短期保存。