PCR反应依然存在各种各样的问题
（1）不出现扩增条带：PCR 反应的关键环节包括模版 DNA 特性、引物的质量与特异性、酶的质量及其活性、PCR 反应条件等，应针对上述环节进行原因分析。首先，模版质和量的不同引起的反应效果可能也不尽相同，模版的来源不同，则在反应中得到用量不同，扩增效
率也会不同。如真核基因组 DNA 作为模版时，其使用量应比原核多，当然模版的纯度也有一定影响，如其中含有杂蛋白质或 Taq 酶抑制剂时，会影响反应效率。其次，由于 Taq 酶容
易失活或污染，会影响反应效果。第三，引物质量、浓度、两条引物的浓度是否一致是影响PCR 反应的常见原因。第四，PCR 产物的电泳检测时间一般为 48h 以内，*好于当日电泳检测，超过 48h 后带型不规则，甚至消失。
（2）假阳性：指阴性样品出现目的 DNA 扩增条带的现象，其原因是存在模版或扩增产物的交叉污染。这种污染有两种可能：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。
这种假阳性的解决方法：
①操作时应小心轻柔,防止将目的 DNA 吸入加样枪内或溅出离心管外。
②所有能高压的试剂或器材均应高压消 du,所用离心管及进样枪头等均应一次性使用。
③必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR 产物,而导致假阳性的产生,可用巢式 PCR 方法来减轻或消除
（3）非特异性扩增带：PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或同时出现多个条带,包括特异性扩增带和非特异性条带。究其原应,首先是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。其次是 Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,或与 PCR 循环次数过多有关。再次是酶不合格或酶量过多。其对策包括重新设计引物,减低酶量或调换另一来源的酶,降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数，适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸)等。
（4）出现片状拖带或涂抹带：PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带,原因可能是模板降解,酶的用量过多或酶的质量差,也有可能是 dNTP 浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多等引起的。解决方法包括更换模板,减少酶用量,适当降低 dNTP 的浓度和 Mg2+浓度,增加模板量,减少循环次数。